丹酚酸A甲基结合代谢物的制备与结构鉴定

1、丹酚酸A甲基结合代谢物的制备与结构鉴定i引言址（Y物起体内吸收"分亦、代谢押排瀝的过段（AlnoipUofi*cliidl'ibmioliniriul11*eitnlMHl*'w'，L：'V-'.r勺Xi他俯标川贯薯新药研发至临嗥应川的个过程扛跖物设计肚新丹吓吃Y期就开展药物诧谢胡于“不仅fl利f擬简新溥研睫的咸功申”还是新药览现和药物设计的莹輕来源*受到国际医脚界的杵遍关注口+SAA乩mR戸只产川I:R,YHgR比声-Ht;2二口kRi-Rh-II3:R产H：一OIt.Kz-Rf-CHc,Rq-HHAtSaLiiuiiolLearidA-SA

2、A）是丹參血也B齐中一神徽量的忒活性謝碗典虫仔，由分予丹參壹与两井予啡16編介而眦图0.是丹卷汹血化券的主要功效诚分闻具有抗氧4t、#t贅、抗ii检带咸舞参种药理祈性，已作为心箱血传保护剂帳选药胸址人开茂阶段釦*与诸多的天嵩多酚类代會胸一惮.分奇在A、C耳上的时邻二附軽墓斷构町的导致saa相怵内堆牛快速M广迂的世谢皱化迖一豪拥己为包搭人源董组蘇体外SU牌在内的处笋卖厮it鮎曝证卖ffl'ftifl.SAA&'1.'j''!；，J：il；i'!.'Ly-f-?":iVi：.-tjIIh>J|.|N.11.Il.dri

3、,J|J.M，.-.IHMI11£订F和/讣"戏转移（trididp-<Iiphoq»hatpplucunniwyhranfifrafieii1VGTfl）代谢性成也括fl和丿盍甲基箱甘在内的姜种II相站件代WW.BAXM挥作内药效榨用的VraXMI生物基慣中的代谢严物邢仅种鬼彝，血且舍臥低Gn事九駅以F水T）*BIT文献眼逍的曲上代谢扬轴拘沟尼基于IXH1S分析的揪测帝果*不能恰出如舁构休在貝体皓穿付賈I的卷粹卑明儒的优学站构佶息从阿琳以弼示兀存怵内的血丈代谢过样.以址ft谢产物的生物活性与化学邸构何的关靈.ISAA&代囲拘1-4的优学牯构bif.

4、ICkembraiEniciun-cJ9ukiiaB.cillj<aillAISAA1find诃*硝tdh討jHe|円1-4本研H杏前期匚忤鲫肚剧I:利川富會COM1'梅的k麗肝細胞液沟醐供纬的体外温孵代谢反向悴虬站自中压柱£析技术，井高制备了4种导体内1致的叩直茁會貨谢物j谆作皿用耐和核磁共报波常方穗躍明FH匕学需构特祗【阳I）相摊州托益集将为捣示SAA的体内代谢过外11堆艮,活性也谢产物凶新杓蹄谨和堆现提供星硝2实验部分2.1仪器纭试剂Agiknt1100高效液*|色谱仪关国Agilent公诃）包括在线脱气机元高Jk衆/动进样ThermoTSQQuantumIccb

5、m处四级杆巾联质ill仪（类国ThennoFhhefSientincInc.）包括电f化接口和Xcalibur色谱I作站与Aplenl1100高效液相色iff仪构成HPLC4IS联用分析系统：BrukerAvan400波谕仪（徳艮Bruker公可）丹酚酸A（纯«98.6%山东靶点药物研究有限公司）:甲硫氨tt（SAM.纯度98%.陕西禅弗生物技术有限公司:乙甲废水UIPU：级.H4-KA公SJ）;ODS（YMCA12S50.50pm.口車）其它渚剂和试剂均为国产分析纯实验用水为超纯水22实验方法221 色讲质讲及孩出共振谱测试条件色潸条件：AgihnlEdipXDB色讲柱（150mm

6、x4.6mm.5|xm）潦动相为乙斷405低甲酸（20：80.II丨检測波|：2S5“山柱汩30七进样也20潦遑ImL/min.质港条件：离子极性为负离子（Negative）.气动辅助电喷雾离子化扫描范附m/z1：细仇输诗泪股350力30“i辅助花压力5barHi?U（氟气）、鞘气氨气）潦速075L/min.tt助气（氮气）潦速05L/min.核峨条件：测试沿度峑汩（295K）.洛林代甲B（Mc）D）.内标四甲扯粧烷（TMS）山1胪C的测试频睾分别为400和100MHz.采样点敌（Tl）65536.等持衰减时niJ（I）E）6y二维谱测试空扫次数（DS）16.222 人仪胆汁采樂与预处理健康消

7、沾级堆性SD人以经乙制轻度麻眸描凰汁收集计侍消隆后收集空白胆汁并以20mg/kg剂量経用静昧注射給fSAA收臬给药后2h内的脚汁FEP管中.®-20七冰箱中保测定NT"汁樺品J复融离心8000!/minxiomin）収|.消液100“加501mol/LHCI祸旋30s.加乙酸乙裔800涡鹿60“超声5min离心（8000r/minxIOmin）取上清液40I水浴卜熬气流吹F加200“色谱滦动相艮溶涡旋60趙声5min.离心（12000r/minX10min）JR上清液待测.223 屮星給合代谢物的体幼陽促汨牌制笹打分禹钙沉淀法分离制為人限肝纸鬼浪法测定蛋口含*孵育体系以田酸

8、盐级冲液（0md/L.pH74）为堆质其中含2mmol儿MgCL.适fit甲堆供体（SAM辅因子）和大敝肝细胞液加入体枳依其中蛋门含城确定）F37七恒温水浴中掘荡预苗育5min加入SAA渚液.继续孵仃15mill后加5mol/LHC1终止反应丁终止反应液中加入5借体枳乙酸乙陆超声捉取痴心R000r/minX10min）.取卜菇液尸4（H：水浴F眾气流吹干残洽芟洛.以ODS为定相，进行中压柱层析分离（20ctnx$1.5cm）以屮醇水泪梯度洗.PLC銀踪监测收如命并保留时何相耐的帑分减爪I叫收落剂后戊空干燥得化介物1.2.3和4.经HPLC检测缶化合物的色讲归一化纯度均庄95%以上适丁进荷结构分

9、析3结果与讨论3.1代谢物的休内外-致性分析在相同色満条件卜分别测定了空门大IR肝细胞液孵介体系（不含SAA）.SAA与大秋肝细胞液体外MWAF体系空口大61胆汁以及大艮尽静脉注射给YSAA后0.211内收集的1E汁样品（f）I1PLC图i帕结果如图2所乐儒中在SAA与大啟肝细胞液体外共需育p图2A&可见除内源性物质受少*未反全的SAA外有4个翌色谗縫根抓色诲出峰先隔依次标记为.2.3W4）.其色帯保胃时间均大TSAA.明在优化的体外孵存条件下SAA被快速完全地代谢牛成4个极件明星低SAA的主要代谢产物.进-步考蔡HIMJ色讲条件卜给药人収胆汁样品的HPLC图魯发现除胆汁内滸性物质和S

10、AA外尚含有多个代谢产物其中14min后的色谧图轮廉与图2B4相似.亦紛出4个主要色幡峰且色谱保留时间宪全致仅在色谗缝的相对髙度匕有所i孔上述结杲农期建工的以大lUff细愿液为他供休的体外他促41牌体系可以快速生成纭休内致的SAA代谢物可作为尺应休系进行体内代谢物的富樂制為/>minm2l|f细胞液liSAA共無育体泵(A)和火孙脚汁(B)的IIPU：Hifflig.2HPI-i.chnimatomms(ifmtlivercytajui)iiu-ubtionsylrmMithSAA(A)jimIratbilesample(B)a.空£(Blaak):b.締药体iSAAoradn

11、siiblMbaofSAA)e3.2代谢物的ESI-MSRlMS2分析在负离了检测模式下对代谢物17及却体化介物SAAiln了ESIiS和MS2分析所紂级质谱的准分了离f(0V!-!')和二级质讲的主S!砕片离子信息见衣结果显示化介物1和23以及J农测定条件下分别绪IB完全致的准分了离了赠和二级质讲碎片衣明为两对界构体，进步liSAAMm/xM-H-比较！2和3.4分别高出14和28amu.示可能为SAA分产结构中酚胫基的单甲贰衣!SAA及代谢协1-4的ES14IS4MS2ttfr：TjI>I<«IFS|-MAndMS*cIjiIji<ifSWjvmIinH

12、jlxdilrx1*4俎分仏mpouml分子离干m/:11-II'inUSl>«ifr«i|nimuinMS*(仔U«r|MMk>SAA493295(100>313(10>1507509(I00>197(17>2507509(100>!97(|4>352109(IOO>.211(16X27(5>4521309(100>211(IS>J27(7>衣!SAA及代谢协1-4的ES14IS4MS2ttfr：TjI>I<«IFS|-MAndMS*cIjiIji<

13、ifSWjvmIinHjlxdilrx1*4和二甲基结介物在二级质讲图中.SAA绪出特征碎片峰m/i295(甚蜂和313分别为戯犍氣缜子两侧的C-0键断裂膚分别中性丢失一分子丹參iUDSS.-198amu)或一分子咖啡ftQCCA.-180amu)的结果.且以前者为优势断裂方式这与酚战类化合物<包括咖啡酸的二聚体三聚体和四聚体)秤遍的二级涪裂解規律“柑吻介；代谢物1-4现与SAAHIM的二级质讲裂解转征均以m/z309为基峰(M-DSS-HM-DSS-14-H)较SAA的里峰高14amu.11/1代谢物1和2的二ftjftift屮尚吋见碎片"1W(DSS-H3川4的二级JJt谊

14、中可見碎片S211(WH"327(M-CA-14-H).上述外果进步捉示代谢物1-4Ufi与SAAMl同的基金骨架在单甲基篩介代谢物1III2屮屮基结合在A环或B坏的酚胫基上而二甲丛給介代谢物3fil4W均应仃个甲基结介在C坏的的炬展上.33代谢物的NMRifi分析瓷质讲分析的丛础上进步直郴同条件下进行了母休化介物SAA及代谢物17的NMK谱测定对比分析SAA的1H和”CNMR信弘同时结介HSQCHMBC等2DNMR谱的待征信息解析了各代谢物中取代甲基的具体连接位置并对卅H和叱NMR信号进行了全归属结果分别见表2和农3.H2SAA及代谢物1-4的FNMRttA：HlK(400Mil/

15、,inMeOD)Table2Fulljigrunrnt<il1IIXMB<lat<ifZAA“rxlntrtbolitr*1-4IIXHB*ASAA««1XlHjbalie1代i«将2MHjixJie227.05(111d</2.0lli>7.16(111.d./»inIV)7.06(111a>56.76(III.<i./=«2lli>6.79(IIId/=«.2ll/>6.74(111.dJ=S2l!i>66.K7(111<|<|./>2QX2Hx：>

16、;7.00(III<|./aK.2lix>690(III.d./>X24Hi)774(IMd"164Hi)7.19(111.d16.4Ih77(ill-d./*16.411/>g6M(III.d16.4lh>665(III."164lh>665(111心/»164111)5-6.74(111.kli>6.75(111d"&4lk>6.97(111.<i./8.4Slit)67.12(lli.<!./=«4Hi>7.12(IIId/»«.4lii>

17、712(Hi.d./SS44lif>T®8.06(111d./.15JJlk>M.06(111.d.J«IS.glli>8X)1(111.<1./«1S.84lli>红fi2(CrUinw<iSTnbl<*2)IInn«*代iM»l代WW211SAA1S*(a>629(ill.d./=15.«lif>6.30(1H.<l./=I5Jll<>630(1H<L/=I5.Mlli>r6.71(IIId"2Qlb>6.72(iH.<L/2

18、.0I1i>6.71IHi.s>y6.64(111.d./KXIID6如(111.d./sSOlk>6.63(111.d八g.Qlh>6*6.55(Hi.<idJ2.0M.Olli>6.55(1Hdd./=7.76lii>6.56(111.d*/«7J0II2753j06(111.I4Jlk>3.06(1Hd"Hi)3X)«(川.d/12.68111)71.2.96(ill.<!<!./8.7.14.3Hi)2.93(111.d.y-B.76lit)2.92(111.r,7(111dd/*4.2.

19、1;.71125.12(111.d丿6.9lfli>5.11(111.br»><MII.3.89(311.t>(HinnA<3"6(311(R讪B4：3Ale>II丹“A代谢将s代11SAAlktel»olilr3MKiidile427.05(Hi.d"2.0lii>7.16(ill>7.0«(III.s>56.76(111.<|./=82lb>679(111<1/s«16lk>6.74(lli.d/=836in>66X7(IIIdd丿=2.Q

20、1;.2Hx>7.(K>(HE<|./=S(Mll<>6.91(III.d/=KJlb)77.14(1l(il.J-164lflx>7.30Wd./=16.44IU)7.!M(ill.d/二164IUg6.M(IMd164Ik)6Q5(III.d16.44lli>(<：-4>6.70(111.<1.“16.4lh>g6.74(III.<|./>84!L>6.77(III.<|./-7.(Ml<z>6.97(111.6lk>72(11!.lh>7.li(III.<|./-

21、71;56llz>7,!0(111.d./36II2T：p>8B6(111.d./-15.«Ik8.0K(1Hd/小Mlli>8.04(111.d./»15.K11/«*ta>IS.glh>6.29(1H<l./<15.M4lli>6.29(111.d丿IS«11/r6.71(111.dJ2j0lit)6.81(111»>6.82(111.s>5*6.64(111.<|./>8X)Iti)6.64(111.<l./»«24lli>6.64(1

22、11.<I./»«.OHi)e6.55(111.<kl./»20.8.0lli>6.74(1Hm>6.75(111.<i.jU6m>7*433(III.143lli>3.13'丨Hd./«1I.S4lli>3.14(III.1八129li/>71.2.96(lli.d<l./«8.7.143lli>299(IHm>299(IMm>r57(111.<M./=42.8.7l<i>5.15(IH.<l/-7.6lii>5.14IIII.

23、<llb>.89(Ml>>(Rin*A-<：3Ak>(311.a>iRin*R：3-Mc>3.76(3H.»>(KhikO<：3*-Me>3.76(3li.«><：-4：3-Ak>农3SAAfkK代谢产物1"的八CNMKtt撫归M(IOOMHz.mMcOD)TaMr3Fullfnrnt<ifMB«!.»!.!«d>Ajn<lmrt.ilxilitcr<I-4丹“A代ww(代谢枸2代谢梅3代谢梅(S.AMeUble12MKAluB

24、lr41128.38128.24127.93128.15127.922120.10120.4012026130.41120.233146.15149.20M6J0814.23146.164146.77M6.9I14643146.83146.535113.96110.5211"7110.61113.716120.45120.601203713062120.597IJ7.17137.80137311X7.79H7.35S116.46116.321I6j63116.37116.59r126.12126.5012635126.20126322-131.421313413234131.3513

25、2.563146.48146.0X1491614630149.204-148.28I4M.I7MM.10148.1914X165115.59116.091140116.03114.X66121.96121.M7HIM121.39121.02T147.38147.M0147.78147.80147.758*116.32116.2011621116.25116.049-168.60I68.S4169J02168.74168.82r1292$130.0)I30j611MI.86130.452*117.38117.3511732114.85112.793-I4S.23145.06146X)2148.7

26、2148.714-14.42144.4014440144.40144.515*114.79114.80I13j67113.97113.93纹fj3(G'Libb3)<:丹fftlffiASAAftwtrilleUlKJitr1代谢枸2MwalioJile2代WW3MHeliolite3代WW4MeUbolilr46*120.66121.5712099123.00122<«T37.953M.293K.543«3931.7274AM74.6574.6674AK74.6«9-173.44173.42173.43173.43173.42OCII,-36

27、.41(C3Ale>56.9(<：3S64X(<3-llr>5635(<：3HA!r56.42(<：3-Mr>56.34(<：3*-Me>测试结果眾示母体化合物SAA的WWnCNMRf；MJ与文献13里本-致其中IINMR讲E的特征信匕包括高场端組3个氮构成的ABXAft系统(52.96.3.06.5.17.均为<ld«).以及两ffl反式二苯乙烯讨架结构上烯虫H7H«<67.14.6.64)和H7H8*<68.06.6.29)的共报吸收峰(均为<1.J>15Ih)oftncNMR带上相应可

28、见饱和亚甲基(6、连氛饱和次甲«(«74.68.OT)及两个按基碳()的特征倍号.W3代谢物I的t：9HMBC佑号卜“.3KryccirfrUlioiufoundinbrtrninuclrjfmulti|>lrbcm<l<*(irTrljli<m(HMB<.)MmrulxilitrI与SAA相比.代谢物1的IINMR沸增加了俎积分值为3的单峰氫信号(6389.J且112和H6的共振吸收佶号显若向低场位移G7.057.16;66.877.00)其余务组包信号的化学位移变化均不超过005|屮m9此同时住“CNMR带上可丸增加仃个连氧的甲丛碳"：356.41)兀庄IFQ(:讲上显示与5389处单蜂氮信号相关进一步农明在代谢物1分子结构中存在一个甲氧塔.C3C5的共振吸收倍匕分别向低场和矗场位移约3ppm(6146.15149.20:5113.96->110.52).其余缶碳信匕的化学位移变化均不超过10ppm.在HMBC讲上