分子生物学实验

1、分 子 生 物 学 实 验河南农业大学生理生化教研室实验操作基本要求实验操作基本要求1. 认真预习认真预习实验指导；实验指导；2. 按照操作规程使用仪器设备按照操作规程使用仪器设备, 注意个人以及注意个人以及公共设施安全公共设施安全；3. 节约节约实验试剂及材料；实验试剂及材料；4. 实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理实验台面；实验台面；5. 按时、按质、按量完成按时、按质、按量完成实验工作，不迟到，实验工作，不迟到，不早退；不早退；6. 实事求是、认真而及时地写出实验报告。实事求是、认真而及时地写出实验报告。质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染

2、色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有15拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10200个，甚至更多拷贝。相关背景1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycineresistance gene, Kanamycine resis

3、tance gene)resistance gene)2.2.启始复制子（启始复制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinkersite or polylinker) )；质粒的结构：质粒的结构：质粒中的多克隆位点细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。SDSSDS是一种阴离

4、子表面活性剂，它既能是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以所以SDSSDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒壁的破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从从细胞中同时释放出来。细胞中同时释放出来。释放出来的释放出来的DNA遇到强碱性（遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将将迅速复性，而基因组迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，由于分

5、子巨大，难以复性。难以复性。离心后，质粒离心后，质粒DNA将在上清中，而基因将在上清中，而基因组组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细从细菌中提取出来。菌中提取出来。*溶液溶液I： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。*溶液溶液20.2mol/L-NaOH, 1%SDS*溶液溶液3乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2O*饱和酚饱和酚(pH8

6、.0 Tris-HCl饱和饱和)*氯仿氯仿*3M乙酸钠溶液乙酸钠溶液(pH5.2)* TE缓冲液缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与乙醇与70乙醇乙醇1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，含有相应抗生素的液体培养基，37培养培养1216小时小时;2. 取液体培养液取液体培养液1.5-3ml于于Eppendorf管中，管中，10000r/min离心离心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100 l溶液溶液I，充分混匀，充分混匀;置冰上

7、置冰上;3. 加入加入200 l新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（溶液（溶液II ），加盖颠倒），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上次使之混匀，冰上放置放置2-3min;4. 加入加入150 l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(溶液溶液III)，加盖后颠倒，加盖后颠倒6-7次混匀，次混匀，冰上放置5min;5. 用台式高速离心机，用台式高速离心机，12000r/min离心离心10min，上清移入另一干净离心管，并加上清移入另一干净离心管，并加3ul RNaseA, 37C保温保温45min;6. 上清中加入等体积的酚上清中加入等体积的酚/氯仿抽提一次氯仿抽提一次,等体积等体积氯仿抽提一次氯

8、仿抽提一次;每次均要振荡每次均要振荡离心离心(10000rpm离心离心1min) 吸取上清到新的离心管中吸取上清到新的离心管中;7. 上清中加入上清中加入1/10 体积体积3M乙酸钠溶液乙酸钠溶液(pH5.2) ,和和2.2倍体积的无水乙醇倍体积的无水乙醇,混匀后混匀后-20保存。保存。8. 12000rpm 离心15分钟，弃去上清，沉淀加入1ml 75乙醇洗涤， 12000rpm 离心2分钟，彻底弃去上清，烘干。9. 沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 电泳检查n接种环接种菌落时，一定要冷却彻底，否则容易接种失败；n提取质粒过程中，每一步都尽量多吸取溶液，以得到更高的产率；n用TE溶解

9、沉淀的时候，用移液器小心吹打几次即可。实验得到的质粒溶液，用电泳法进行检测，下图为提取的质粒电泳照片，所得结果比较好返回目录返回目录多聚酶链式反应多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的：是一种对特定的DNA片段在片段在体外进行快速扩增的方法。体外进行快速扩增的方法。1985年年 Kary Mullis及同事创立。随后借及同事创立。随后借助于热稳定性助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现，使聚合酶的发现，使PCR自动化成为可能；自动化成为可能；1987年年Kary Mullis等完成了等完成了自动化操作装置，使自动化操作装置，使PCR技术

10、进行实用阶段。技术进行实用阶段。1993年度，年度，Kary Mullis因发明了因发明了“聚合酶链式聚合酶链式反应反应”而获得诺贝尔化学奖。而获得诺贝尔化学奖。相关基础知识相关基础知识类似于类似于DNA的变性和复性过程，即在高温的变性和复性过程，即在高温（93-95）下，待扩增的靶）下，待扩增的靶DNA双链受热变性双链受热变性成为两条单链成为两条单链DNA模板；模板；而后在低温（而后在低温（3765）情况下，两条人）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结模板结合，形成部分双链；合，形成部分双链；在在Taq酶的最适温度（酶的最适温度（72）下

11、，以引物）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成方向延伸，合成DNA新链。新链。 这样，每一双链的这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链链DNA分子。分子。如此反复进行，每一次循环所产生的如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以产物得

12、以2n的批数形式迅速扩增，经过的批数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，倍以上，实际上一般可达实际上一般可达106107倍。倍。PCR 的特点及应用：的特点及应用：PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。量要求低。因此，广泛应用于许多领域。1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量获得突变体、提供大量DNA用于测序等；用于测序等；2. 遗传病的产前诊断；遗传病的产前诊断；3. 致

13、病病原体的检测；致病病原体的检测；4. 癌基因的检测和诊断；癌基因的检测和诊断；5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；6. 动、植物检疫；动、植物检疫；7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。在转基因动植物中检查植入基因的存在。PCR PCR 反应系统的组成反应系统的组成PCRPCR反应系统的组成主要包括：反应系统的组成主要包括： 引物、寡核苷酸引物、寡核苷酸 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 模板模板DNADNA、缓冲液、缓冲液引物：引物：要扩增模板要扩增模板DNADNA，首先要设计两条寡核，首先要设计两条寡核苷酸引物苷酸引物,

14、 ,实际上就是两段与待扩增靶实际上就是两段与待扩增靶DNADNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定间距离决定扩增片段的长度扩增片段的长度，两引物的，两引物的55端决定扩增产物的两个端决定扩增产物的两个55末端位置。末端位置。由于引物是决定由于引物是决定PCRPCR扩增片段长度、位扩增片段长度、位置和结果的关键，置和结果的关键， 因此，引物设计也因此，引物设计也就更为重要就更为重要。PrimerIPrimerIIAmplified target fragment引物的设计：引物的设计：1.1. 长度一般最低不少于长度一般最低不少于1616个核苷酸，最佳长度为个

15、核苷酸，最佳长度为20202424个核苷酸。有时可在个核苷酸。有时可在55端添加不与模板互端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的55端加上端加上额外的核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。额外的核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。2.2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物两个引物之间不应发生互补，特别是在引物33端，端，即使无法避免，其即使无法避免，其33端互补碱基也不应大于端互补碱基也不应大于2 2个个碱基，否则易生成碱基，否则易生成“引物二聚体引物二聚体”或或“

16、引物二倍引物二倍体体”（Primer dimerPrimer dimer）。）。3.3. (G+C(G+C）% %含量引物的组成应均匀，两个引物中含量引物的组成应均匀，两个引物中（G+CG+C）% %含量应尽量相似。含量应尽量相似。4.4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（是发夹结构（hairpin structureshairpin structures）。）。引物在引物在PCRPCR反应中的浓度反应中的浓度一般在一般在0.10.11M1M之间。浓度过高之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。易形成引物二聚体且产生非特

17、异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成浓度过低，不足以完成3030个循环的扩增个循环的扩增反应，则会降低反应，则会降低PCRPCR的产率。的产率。引物退火温度引物退火温度决定决定PCRPCR特异性与产量；温度高特异性强，特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNADNA扩增效扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。板错配，非特异性产物增加。一般可根据引物的（一般可根据引物的（G+CG+C）% %含量进行推

18、测，含量进行推测，一般实验中退火温度可按公式进行粗略计算：一般实验中退火温度可按公式进行粗略计算：Ta = Tm - Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -55= 4(G+C) + 2(A+T) -5其中其中A A，T T，G G，C C分别表示相应碱基的个数。在典分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如型的引物浓度时（如0.2mol/L0.2mol/L）, ,退火反应数退火反应数秒即可完成。秒即可完成。引物延伸温度引物延伸温度温度的选择取决于温度的选择取决于DNADNA聚合酶的最适温度。聚合酶的最适温度。一般取一般取70707575，在，在7272时酶催化核苷酸的

19、标时酶催化核苷酸的标准速率可达准速率可达3535100100个核苷酸个核苷酸/ /秒。秒。对于对于1kb1kb以上的以上的DNADNA片段，可根据片段长片段，可根据片段长度将延伸时间控制在度将延伸时间控制在1 17min7min。寡核苷酸（寡核苷酸（dNTPdNTP）在在PCRPCR反体系中反体系中,dNTP,dNTP终浓度高于终浓度高于50mM50mM会抑制会抑制TaqTaq酶的活性，使用低浓度酶的活性，使用低浓度dNTPdNTP可以减少在可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度浓度dNTPsdNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，易产生错误掺

20、入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。势必降低反应物的产量。PCRPCR常用的浓度为常用的浓度为5050200M200M，不能低于，不能低于101015M15M。四种。四种dNTPdNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。合成速度，过早终止反应。TaqTaq DNA DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。来的。PCRPCR反应混合物中，催化一典型的反应混合物中，催化一典型的PCRPCR所所用酶量为用酶量为2U2U。常用范围为

21、。常用范围为1 14U/100l4U/100l。由于。由于DNADNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。致非特异产物的增加。TaqTaq酶有酶有5 35 3外切酶活性，但无外切酶活性，但无3355外切核酸酶校正活性，无法校正外切核酸酶校正活性，无法校正DNADNA合成过程合成过程中产生的错配。中产生的错配。 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: :单、双链单、双链DNADNA或或RNARNA都可以作为都可以作为PCRPCR的样品。的样品。若起始材料是若

22、起始材料是RNARNA，须先通过逆转录得到第一条，须先通过逆转录得到第一条cDNAcDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的而直接用做模板。当使用高分子量的DNADNA（如基（如基因组因组DNADNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。化再作为模板，扩增效果会更好。对于模板的用量来说，虽然对于模板的用量来说，虽然PCRPCR可以仅用极可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞

23、的微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNADNA，但为，但为了保证反应的特异性，还应用了保证反应的特异性，还应用ngng级的级的DNADNA。模板模板模板变性温度模板变性温度是决定是决定PCRPCR反应中双链反应中双链DNADNA解链的温度，解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链达不到变性温度就不会产生单链DNADNA模板，模板，PCRPCR也就不会启动。变性温度低则变性不完也就不会启动。变性温度低则变性不完全，全，DNADNA双链会很快复性，因而减少产量。双链会很快复性，因而减少产量。一般取一般取90909595。样品一旦到达此温度宜迅。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。速冷却到退火温

24、度。DNADNA变性不需要时间过变性不需要时间过久，在高温时间应尽量缩短，以保持久，在高温时间应尽量缩短，以保持DNADNA聚聚合酶的活力，加入合酶的活力，加入TaqTaq DNADNA聚合酶后最高变聚合酶后最高变性温度不宜超过性温度不宜超过9595。PCRPCR缓冲液缓冲液: :用于用于PCRPCR的标准缓冲液为的标准缓冲液为101050mM50mM的的Tris Tris HClHCl缓冲液（缓冲液（pH8.3pH8.3）和）和1.5mM MgCl1.5mM MgCl。在。在7272时，反应体系的时，反应体系的pHpH值将下降值将下降1 1个单位，接近于个单位，接近于7.27.2。二价阳离子

25、的存在至关重要，影响。二价阳离子的存在至关重要，影响PCRPCR的的特异性和产量。实验表明，特异性和产量。实验表明，MgMg2+2+优于优于MnMn2+2+，而，而CaCa2+2+无任何作用。无任何作用。MgMg2+2+过量易生成非特异性扩过量易生成非特异性扩增产物，增产物，MgMg2+2+不足易使产量降低。首次使用靶不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把序列和引物结合时，都要把MgMg2+2+浓度调到最佳，浓度调到最佳，其浓度变化范围为其浓度变化范围为1 110mmol/L10mmol/L。PCRPCR循环次数循环次数常规常规PCRPCR循环次数一般为循环次数一般为252540

26、40个周个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。率前提下，应尽量减少循环次数。PCRPCR扩增过程扩增过程 在微量离心管中加入适量缓冲液、在微量离心管中加入适量缓冲液、微 量 模 板微 量 模 板 DNADNA、 四 种 脱 氧 单 核 苷 酸、 四 种 脱 氧 单 核 苷 酸（dNTPdNTP）和耐热）和耐热TaqTaq聚合酶及两个合成聚合酶及两个合成DNADNA引物，并有引物，并有M

27、gMg2+ 2+ 存在。其循环的温存在。其循环的温度取决于引物的度取决于引物的TmTm值、模板的种类以及值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。聚合酶的耐热性。(1)(1)变性阶段变性阶段 加热使模板加热使模板DNADNA在高温下在高温下（90-9590-95）变性，双链解链；）变性，双链解链；(2)(2)退火阶段退火阶段 降低溶液温度，使合成引降低溶液温度，使合成引物在低温（物在低温（353565,65,一般低于模板一般低于模板TmTm值的值的55左右），与模板左右），与模板DNADNA互补退火互补退火形成部分双链；形成部分双链；(3)(3)延伸阶段延伸阶段 溶液反应温度升至中温溶液反应温度升至中

28、温(72)(72)，在，在 TaqTaq酶作用下，以酶作用下，以dNTPdNTP为为原料，引物为复制起点，模板原料，引物为复制起点，模板DNADNA的一的一条双链在解链和退火之后延伸为两条条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。双链。PCR Mixture:Template DNA: 1 l (10ng) Primer 1: 1 l (10 M) Primer 2: 1 l (10 M) dNTPs: 1 l (10mM each) Taq DNA polymerase: 0.5 l(5U/ l)10buffer: 5 l25mM MgCl2: 3 lddH2O: 37.5 l Total: 5

29、0 l将将PCRPCR反应体系加好混匀后，按照下面步反应体系加好混匀后，按照下面步骤调好骤调好PCRPCR仪，开始扩增仪，开始扩增9494变性变性2.5min2.5min后开始以下循环后开始以下循环 9494变性反应变性反应30 sec30 sec； 5656退火反应退火反应30 sec30 sec； 7272延伸反应延伸反应1 min1 min； 进行进行3030个循环；个循环； 最后最后7272反应反应7min7min； 4 4 冷却恒定。冷却恒定。n在加在加PCRPCR反应体系时，由于涉及试剂较多，容易出反应体系时，由于涉及试剂较多，容易出现漏加、多加现象，须认真操作，多加注意；现漏加、

30、多加现象，须认真操作，多加注意；n加完反应体系后，应在离心机中稍微离心一下，加完反应体系后，应在离心机中稍微离心一下，使所加试剂混匀后再放到使所加试剂混匀后再放到PCRPCR仪中反应。仪中反应。取取5 5 l PCRl PCR产物，采用产物，采用1.01.0琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳分析电泳分析PCRPCR产物的量、引物扩增的特异性。产物的量、引物扩增的特异性。下图为比较好的实验结果。下图为比较好的实验结果。PCRPCR结果：结果：DNA MarkerPCR product学生实验结果学生实验结果(4 l)返回目录返回目录相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双限制性核酸内切酶

31、：是一类能识别双链链DNADNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNADNA水解酶。是水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。酶。限制性核酸内切酶不仅是限制性核酸内切酶不仅是DNADNA重组中重重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。的鉴定。1) 1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段段。 各种细菌都能合成一种或几种能够切割各种细

32、菌都能合成一种或几种能够切割DNADNA双链的核酸内切酶，双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源它们以此来限制外源DNADNA存在于自身细胞内，但合成存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞这种酶的细胞自身的自身的DNADNA不受影响，因为这种细胞还合成了不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的一种修饰酶，对自身的DNADNA进行了修饰，限制进行了修饰，限制性酶对修饰过的性酶对修饰过的DNADNA不能起作用。不能起作用。这种现象被这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。称为寄主控制的限制与修饰现象。2)2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性

33、关系按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及以及切断核酸的情况不同，分为三类切断核酸的情况不同，分为三类： 型型 型型* * 型型第一类（第一类（I I型）限制性内切酶型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割别点附近的一些核苷酸上切割DNADNA分子中分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在性，是随机的。这类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析于分析DNADNA结构或克隆基因。这类酶如结构或克隆基因。

34、这类酶如EcoEcoB B、EcoEcoK K等。等。 第二类第二类(II(II型型) )限制性内切酶限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这种酶识别的专内的固定位置上切割双链。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是一核苷酸顺序最常见的是4 4个或个或6 6个核苷酸，少个核苷酸，少数也有识别数也有识别5 5个核苷酸以及个核苷酸以及7 7个、个、8 8个、个、9 9个、个、1010个和个和1111个核苷酸的。个核苷酸的。 II II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这

35、个轴文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向朝二个方向“读读”都完全相同。这种酶的切割都完全相同。这种酶的切割可以有可以有两种方式两种方式：粘性末端：粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 GAA|TT_C 35 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧“读读”核苷酸顺序都是核苷酸顺序

36、都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这就是回文顺序（，这就是回文顺序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二个二个DNADNA片段，各片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置上切型酶切割方式的另一种是在同一位置上

37、切割双链，产生平头末端。例如割双链，产生平头末端。例如EcoEcoRVRV 的识别的识别位置是：位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。这种末端同。这种末端同样可以通过样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：第三类（第三类（ IIIIII型）限制性内切酶型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序文顺序, ,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定在

38、识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度一定长度DNADNA片段，具有各种单链末端。因此片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。不能应用于基因克隆。3) 3) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用用Eco表示，所以用斜体字。表示，所以用斜体字。v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜

39、血菌用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌RdRd菌株用菌株用d d，即，即Hind d。v 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如Hind, d, Hindd，Hindd等。等。4) 4) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA(1) DNA的纯度；的纯度；(2) (2) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(3) (3) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(4) (4) 缓冲液的缓冲液的 pHpH值。值。EcoEcoR R I I 酶切位

40、点：酶切位点：GAATT_CGAATT_CHindIIIHindIII 酶切位点：酶切位点：AAGCT_TAAGCT_T1010 buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl酶活性的定义：酶活性的定义：一个活性单位（一个活性单位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反应体系中，反应体系中，3737o oC C的条件下，经过的条件下，经过1 1

41、小时的反应时间，将小时的反应时间，将1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。司会给用户提供这方面的信息。学习限制性内切酶的特性、酶解的操作方学习限制性内切酶的特性、酶解的操作方法；法；掌握利用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定掌

42、握利用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNADNA片片段的有效方法。段的有效方法。 ddH2O、10XBuffer、Plasmid、 EcoRI、HindIIIddH2O : 8.4ul10XBuffer: 2 ulPlasmid: 10 ulEcoRI : 0.5 ulHindIII : 0.5ul1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切后直接进行电泳检测，下图是较好的酶切结果。酶切结果。返回目录返回目录n学习学习DNADNA纯化的原理和方法；纯化的原理和方法；n掌握利用试剂盒从凝胶中回收掌握利用试剂盒从凝胶中回收DNADNA。 DNADNA片段的纯化：片段

43、的纯化： DNADNA纯化的主要目的是回收纯化的主要目的是回收得到纯的目的得到纯的目的DNADNA片段，去除影响片段，去除影响DNADNA连接酶活性的连接酶活性的物质以及其它的物质以及其它的DNADNA片段。片段。纯化纯化DNADNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从出了直接从 PCRPCR产物中或琼脂糖凝胶中回收产物中或琼脂糖凝胶中回收DNADNA片片段的试剂盒，有效地加快了段的

44、试剂盒，有效地加快了DNADNA的纯化的速度。的纯化的速度。1)1) 用用1%1%琼脂糖凝胶电泳分离上次的琼脂糖凝胶电泳分离上次的PCRPCR片段片段(marker(marker为为66l 100bp DNA ladder)l 100bp DNA ladder)，紫，紫外灯下观察染色条带；外灯下观察染色条带；2)2) 用干净的刀片切出所需用干净的刀片切出所需DNADNA条带，注意要在条带，注意要在长波长（长波长（300nm300nm）UVUV灯下灯下( (如果有的话如果有的话) )操操作，并快速操作，以免损伤作，并快速操作，以免损伤DNADNA。应尽可能。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶；多地去除琼

45、脂糖凝胶；3)3) 将切下的琼脂糖凝胶放入离心管中，称重，将切下的琼脂糖凝胶放入离心管中，称重，（空管预先称重），计算凝胶重量；（空管预先称重），计算凝胶重量；4 4）按照）按照100mg100mg凝胶加入凝胶加入700ul700ul的比例加入溶胶液，的比例加入溶胶液，5555水浴放置水浴放置5-105-10分钟，其间偶尔颠倒离心管数分钟，其间偶尔颠倒离心管数次，至凝胶完全融化；（凝胶重量尽量小于次，至凝胶完全融化；（凝胶重量尽量小于100mg)100mg)5 5）将离心管中的溶液转移到吸附柱中，室温放置）将离心管中的溶液转移到吸附柱中，室温放置1 1分钟，分钟，1200012000转离心转离

46、心0.50.5分钟分钟, ,吸附柱容量约吸附柱容量约800800l, l, 一次上不完可分两次上样；一次上不完可分两次上样；6 6）取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，向吸附柱中）取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入加入500ul500ul漂洗液漂洗液(Wash Buffer), 12000(Wash Buffer), 12000转离心转离心0.50.5分钟；分钟；7 7）重复一次步骤重复一次步骤6 6；8) 8) 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，1200012000转转离心离心2 2分钟；分钟；9 9）吸附柱放入新的离心管中，在吸附柱的膜中）吸附柱放入新

47、的离心管中，在吸附柱的膜中 央加入央加入30ul 30ul 洗脱缓冲液洗脱缓冲液( (或或TETE溶液溶液) )，室温放，室温放 置置2 2分钟；分钟；1010）1200012000转离心转离心1 1分钟分钟 PCR实验结果实验结果PCR 产物纯化后产物纯化后返回目录返回目录n掌握掌握DNADNA连接的原理；连接的原理；n学会用基本的酶切连接的方法。学会用基本的酶切连接的方法。返回目录返回目录n了解细胞转化的概念及其在分子生物学研了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义究中的意义；n学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒外源质粒DNA转入受体菌细

48、胞的技术转入受体菌细胞的技术。感受态细胞感受态细胞(Competent cells)受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，等化，等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感的载体分子通过的感受态细胞受态细胞(competent cell) 。 转化（转化（transformation）是将异源是将异源DNA分子引入一细胞株系，使分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。因

49、工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：转化的方法：1. 化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体理将载体DNA分子导入受体细胞；分子导

50、入受体细胞；2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。克隆的筛选：克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。质粒。重组重组DNADNA转化细转化细菌过程示意图菌过程示意图1 1）大肠杆菌感受态细胞的制备