多肽合成详细解说

1、多肽合成详细解说1 .多肽化学合成概述：1963 年，R.B.Merrifield1创立了将氨基酸的 C 末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法,在固相法中，一每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield 获彳导1984 年诺贝尔化学奖.今天，固相法得到了很大发展.除了 Merrifield 所建立的 Boc 法（Boc:叔丁氧厥基）之外，又发展了 Fmoc 固相法（Fmoc:9-药甲氧玻基）.以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和

2、发展，并仍在不断得到改造和完善.Merrifield 所建立的 Boc 合成法2是采用 TFA（三氟乙酸）可脱除的 Boc 为“-氨基保护基，侧链保护采用节醇类.合成时将一个 Boc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上， 用 TFA 脱除 Boc,用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过 Dcc 活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用 HF 法或 TFMSA（三氟甲磺酸）法.用 Boc 法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等.多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们

3、已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核甘酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。从 1963 年 Mer

4、rifield 发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化竣基组分反应，接长肽链。重复（缩合一洗涤一去保护一中和及洗涤一下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中“-氨基用 BOC（叔丁氧默基）保护的称为 BOC 固相合成法，a-氨基用 FMOC（9-药甲氧玻基）

5、保护的称为 FMOC 固相合成法，2 .固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从 C 端（蝮基端）向 N 端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。竣基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即 Fmoc和 tBoc。由于 Fmoc 比 tBoc 存在很多优势，现在大多采用 Fmoc 法合成，如图:具体合成由下列几个循环组成:一、去保护：Fmoc 保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基

6、的保护基团。二、激活和交联：下一个氨基酸的竣基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。三、洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。2.1 树脂的选择及氨基酸的固定将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连

7、接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、竣基树脂、氨基树脂或酰肿型树脂。BOC 合成法通常选择氯甲基树脂，如 Merrifield 树脂；FMOC 合成法通常选择竣基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的竣基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨

8、基酸的四甲俊盐或钠盐、钾盐、葩盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF 或 DMSO 中反应；竣基树脂，则通常加入适当的缩合剂如 DCC 或竣基二咪口坐，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肿型树脂，却是加入适当的缩合剂如 DCC 后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。氨基、竣基、侧链的保护及脱除要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和竣基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧玻基类型作为“氨基的保护基，因为这样不

9、易发生消旋。最早是用茉氧玻基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧厥基（BOC）保护，用 TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。1978年，changMeienlofer 和 Atherton 等人采用 Carpino 报道的 Fmoc（9-药甲氧玻基）作为 a 氨基保护基，Fmoc 基对酸很稳定，但能用哌咤-CH2CL2 或哌咤-DMF 脱去，近年来，Fmoc 合成法得到了广泛的应用。竣基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护竣基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肿以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；节酯常用催化氢化除去

10、。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的 S-,用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪陛环用 2,2,2-三氟-1-茉氧厥基和 2,2,2-三氟-1-叔丁氧玻基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧玻基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及竣基被保护的氨基

11、酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将竣基活化，变成混合酸酎、 活泼酯、 酰氯或用强的失去剂 （如碳二亚氨） 形成对称酸酎等方法来形成酰胺键。 其中选用 DCC、HOBT 或 HOBT/DCC 的对称酸酎法、活化酯法接肽应用最广。一|裂解及合成肽链的纯化 BOC 法用 TFA+HF 裂解和脱侧链保护基，FMOC 法直接用 TFA,有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。4 .固相合成的特点及存在的主要问题固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一

12、简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。5 .固相合成的研究发展前景固相多肽合成已经有 40 年的

13、历史了，然而到现在，人们还只能合成一些较短的肽链，更谈不上随心所欲地合成蛋白质了，同时合成中的试剂毒性，昂贵费用，副产物等一直都是令人头痛的问题，而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后多肽合成的发展。在 Boc 合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50%TFA 脱 Boc 基时，有约 1.4%的肽从树脂上脱落，合成的肽越大，这样的丢失越严重；此外，酸催化会引起侧链的一些副反应.Boc 合成法尤其不适于合成含有色氨酸

14、等对酸不稳定的肽类.1978 年，Chang、Meienlofer 和 Atherton 等人采用 Carpino3报道的 Fmoc（9-药甲氧玻基）基团作为一氨基保护基，成功地进行了多肽的 Fmoc 固相合成.Fmoc 法与 Boc 法的根本区别在于采用了碱可脱除的 Fmoc 为厂氨基的彳护基.侧链的保护采用 TFA 可脱除的叔丁氧基等，树脂采用 90%TFA 可切除的对烷氧茉醇型树脂和 1%TFA可切除的二烷氧茉醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理6 .HPLC 分析和纯化分析 HPLC 使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10Wm）做填料。由此多肽要在几分钟内高

15、度被分析。HPLC 分两类：离子交换和反相。离子交换 HPLC 依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定 PH 范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用，通过可变 PH,离子强度，或两者洗脱出多肽，通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如 sulfoethylaspartimide 通过酸性 PH 中带正电来分离。反相 HPLC 条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱，如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上

16、的碳氢烷链构成，这种链长度为 G4-G8碳原子。由于洗脱是一种疏水作用。大的疏水肽用短链柱洗脱好。然而，总体实践中，这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成，比如苯基。典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o 和 80%acetonitrile0.1%TFA-H2o 稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟 0.5%到 1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为 4.6X250mm（3-10 科 m）和 22X250mm（10 科 m）.如果用径向填柱，那么大小是 8X100（3-10 科 m）和 25X250mm（10 科 m）大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如

17、 heptafluorobutyric 酸，0.1%磷酸，稀 Heformic酸（5-6%,pH2-4）,10-100mMNH4HCO3,醋酸钠/氨，TFA/TEA,磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高 pH,甚至微碱 pH,因为这样会破坏柱子。7 .Fmoc 一氨基酸的制备和侧链保护Fmoc基团是在有 NaHCO3或 Na2CO3存在的二氧六环溶液中， 通过以下反应引入到氨基酸中的：理想的 Fmoc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定，在酸性条件下脱除.下面对其做一介绍.7.1Asp 和 GluAsp 和 Glu 侧链竣基常用 t-B

18、u 保护.可用 TFA、TMSBr 等脱除.但是用 t-Bu 保护仍有侧链环化形成酰亚胺的副反应发生.近年来，发展了一些新的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用 TMSOTf（三氟甲磺酸三甲硅烷酯）除去.7.2Ser、Thr 和 Tyrser、Thr 的羟基及 Tyr 的酚羟基通常用 t-Bu 保护.叔丁基的引入比较麻烦，首先 ser 制成茉氧玻基酯，再在酸催化下与异丁烯反应.Ser 和 Thr 还可用茉基保护，Ser 用茉醇引入茉基、Thr 用澳茉引入茉基.7.3Asn 和 GlnAsn 和 Gln 侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时，Asn 和 G

19、ln 的一竣基活化时可能会发生分子内月氢反应生成氟基化合物.碱性时 Gln 的侧链可以环化生成酰胺.而且不保护的 Fmoc-Gln 和 Fmoc-Asn 在 DCM 中溶解度很差.为了避免这些问题， 可以用 9-咕吨基，2,4,6-三甲氧茉基，4,4一二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用 TFA 脱除.7.4HisHis 是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护对咪陛环的非兀-N开始用芳基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl 需要用氢解或 Na/NHs 除去，并且产生很大程度消旋.Boc 基团是一个较理想的保护基，降低了咪陛

20、环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌咤厥基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如对咪口坐环兀-N 保护，可以完全抑制消旋，兀-N 可以用茉氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保护，(Bum)可以用 TFA 脱除，Bom 更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的 His 侧链保护基，其不足之处在于 Fmoc(His)Bum 在 DCM 和 DMF 中的溶解度较差.7.5CysCys 的SH 具有强亲核性，易被酰化成硫醛，也易被氧化为二硫键，必须加以保护.常用保护基有三类：一类用 TFA

21、 可脱除，如对甲茉基、对甲氧茉基和三苯甲基等；第二类可用(CF3CO)3T1/TFA 脱除，对 TFA 稳定.如 t-Bu、Bom 和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如芳基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用前基试剂和磷试剂还原，Cys(Bzl)可用 Na/NH3(1)脱保护.7.6ArgArg 的月瓜基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护 1 或 2 个月瓜基氮原子.保护基分四类：(1)硝基(2)烷氧玻基(3)磺酰基(4)三苯甲基.硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧玻基应主要有 Boc 和二金刚烷氧厥基(Adoc)2、Fmo

22、c(Arg)Boc 的耦联反效率不高，哌咤理时不处稳定，会发生副反应；Adoc 保护了两个非兀N,但有同样的副反应发生.对磺酰基保护， 其中TOS应用最广， 但它较难脱除.近年来2,3,6-三甲基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)较受欢迎，在 TFA 作用下，30 分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用 TFA 脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在 DCM、DMF 中溶解度不好.7.7LysLys 的-NH2 必须加以保护.但与 a-NH2 的保护方式应不同，该保护基要到肽链合成后除去.-NH2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基，其它常用的保护基有节氧碳基

23、和 Boc.7.8Fmoc 基团的脱除Fmoc 基团的药环系的吸电子作用使 9-H 具有酸性，易被较弱碱除去，反应条件很温和反应过程可表示如下：哌咤进攻 9-H,3 消除形成二苯药烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物.Fmoc基团对不同的碱稳定性不同，可根据实际条件选用7.9耦联反应固相中的接肽反应原理与液相中基本一致.将两个相应的氨基被保护的及竣基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常用的手段是将竣基活化，其方法是将它变成混合酸酎，或者将它变为活泼酯、酰氯，或者用强的失去剂(碳二亚胺)也可形成酰胺键，耦联反应可表示如下：(A:默基活泼试剂)碳二亚胺是常用的活化试剂，其

24、中 Dcc 使用范围最广，其缺点是形成了不溶于 DCM 的 DCH,过滤时又难于除尽.其他一些如二异丙基碳二亚胺（DCI）、甲基叔丁基碳二亚胺也用于固相合成中，它们形成的月尿溶于 DCM 中，经洗涤可以除去.其他活化试剂，还有 Bop（BopC1）、氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯、SOC12 等.其中 Dcc、Bop 活化形成对称酸酎、SOC12 形成酰氯，其余三种形成不对称酸酎.7.10 对称酸酎法用 Dcc 形成对称酸酎的方法使用较广.其缺点是有些氨基酸在 DCM 中不易溶解，生成的 Fmoc 氨基酸酎溶解度更差.同时还有些副反应，如形成二肽、消旋等7.11 混合酸酎法最常用试剂是氯甲酸的异丙基酯和异丁基酯.前者得到的酸酎稳定性好.只产生很少消旋，在适当的化学计量及溶剂条件下，耦联反应很快.而且，在此反应中使用的 N-甲基吗咻和 N-甲基哌咤对 Fmoc 基团无影响7.12 酰氯法在 Boc 法中不常用的酰氯，因为比较激烈，一些保护基如 Boc 不稳定.但是，Fmoc 基团可以耐受酰氯处理，生成的 Fmoc 氨基酰氯也很稳定.在三甲基乙酸/三胺或苯并三氮陛/二异丙基乙二胺中，反应速度很快，消旋