第五章 基因与克隆载体的体外重 ...

1、 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程目的基因与克隆载体的目的基因与克隆载体的体外重组体外重组基因重组克隆与亚克隆基因重组克隆与亚克隆 体外连接重组体外连接重组DNADNA分子的特点：分子的特点： （1 1）DNADNA体外连接减少了体外连接减少了 DNADNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，险，增加了转化效率增加了转化效率； （2 2）由于限制性内切内产生的粘端在体外连接，使原来酶的识）由于限制性内切内产生的粘端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个别序列在整个DNADNA中维持完整性，中维持完整性，有利于在重组子转化扩增后再有利于在重组子转

2、化扩增后再对外源基因进行分离；对外源基因进行分离； （3 3）连接时可控制连接反应条件，）连接时可控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几有利于形成环状分子或者几个个DNADNA片段头尾相连接的直线多联体片段头尾相连接的直线多联体。 把把DNADNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体，例如片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体，例如从重组的从重组的噬菌体克隆到质粒，或者从某种质粒克隆到另一种噬菌体克隆到质粒，或者从某种质粒克隆到另一种质粒，这种过程称为质粒，这种过程称为亚克隆亚克隆。亚克隆通常是将较大的克隆片段。亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小经酶切后，再将所有

3、的小DNADNA片段与另一载体连接、转化的程序。片段与另一载体连接、转化的程序。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程基因重组对载体的要求与载体类型基因重组对载体的要求与载体类型选用克隆载体还是表达载体？选用克隆载体还是表达载体？表达型载体是能够使外源基因在宿主细胞内进行高效率表达的载表达型载体是能够使外源基因在宿主细胞内进行高效率表达的载体，一般要有体，一般要有强启动子强启动子和和正确的终止子正确的终止子，能够高效地高拷贝地转，能够高效地高拷贝地转录目的基因并且产生稳定的录目的基因并且产生稳定的mRNAmRNA。强启动子组建的高表达载体一般有三类：强启动子组建的高表达载体

4、一般有三类： （1 1）含）含噬菌体的噬菌体的pLpL启动子的质粒：启动子的质粒： 噬菌体的噬菌体的pLpL启动子是一启动子是一个很强且容易调控的启动子。温度敏感型载体。个很强且容易调控的启动子。温度敏感型载体。 （2 2）含）含LacLac启动子的质粒：启动子的质粒： LacLac启动子是启动子是LacZLacZ基因前的一个强启基因前的一个强启动子。动子。 （3 3）含）含trptrp启动子的质粒：启动子的质粒： trptrp启动子是大肠杆菌色氨酸操纵子启动子是大肠杆菌色氨酸操纵子中的强启动子。中的强启动子。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程 DNADNA体外重组是将

5、目的基因（外源体外重组是将目的基因（外源DNADNA片段）用片段）用DNADNA连接酶在体外连接到合适的载体连接酶在体外连接到合适的载体DNADNA上，这种上，这种重新组合的重新组合的DNADNA称为称为重组重组DNADNA。主要依赖于主要依赖于限制性限制性内切酶内切酶和和DNADNA连接酶连接酶。 考虑因素：考虑因素： 1 1. .步骤尽可能简单；步骤尽可能简单； 2 2. .连接形成的接点序列，应能被某种限制酶重新连接形成的接点序列，应能被某种限制酶重新切割，以便回收插入的外源切割，以便回收插入的外源DNADNA片段；片段； 3 3. .对转录和转译过程中密码结构的阅读应不发生对转录和转译

6、过程中密码结构的阅读应不发生干扰。干扰。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程 粘性末端连接法粘性末端连接法 定向克隆法定向克隆法 平末端连接法平末端连接法 同聚物加尾法同聚物加尾法 加人工接头连接法加人工接头连接法 加加DNADNA衔接物连接法衔接物连接法目的基因与质粒载体的连接目的基因与质粒载体的连接 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程 粘性末端连接法粘性末端连接法一般程序一般程序：选用一种对载体选用一种对载体DNADNA只具只具惟一限制位惟一限制位点点的限制酶（如的限制酶（如EcoR IEcoR I）作位点特异切割。经作位点特异切割。经此酶消化之

7、后就会形成全长的具粘性末端的线此酶消化之后就会形成全长的具粘性末端的线性性DNADNA分子。再将外源分子。再将外源DNADNA大片段也用同一种限大片段也用同一种限制酶作同样的消化，随后，把这两种经过酶切制酶作同样的消化，随后，把这两种经过酶切消化的外源消化的外源DNADNA和载体和载体DNADNA混合混合起来，加入起来，加入DNADNA连连接酶，由于具有相同的粘性末端，因此能够退接酶，由于具有相同的粘性末端，因此能够退火形成双链结合体。火形成双链结合体。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程TGCAACGTTGCATGCAACGTACGT限制酶限制酶限制酶限制酶GCATTA

8、CGGCATTACGT4DNA连接酶连接酶TGCATGCAACGTACGT载体载体外源外源DNADNA片段片段粘性末端连接法粘性末端连接法 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程防止载体自身再环化防止载体自身再环化 由限制酶产生的具有相同粘性末端的载体由限制酶产生的具有相同粘性末端的载体DNADNA分分子，在反应混合物中会发生子，在反应混合物中会发生自身环化自身环化作用，也有作用，也有可能形成可能形成串联寡聚物串联寡聚物，并在连接酶的作用下重新，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环状结构。变成稳定的共价闭合的环状结构。 调整两种调整两种DNADNA的浓度；的浓度； 用

9、用碱性磷酸酶碱性磷酸酶（BAPBAP或或CIPCIP）处理线性载体处理线性载体DNADNA分分子，去除线状载体子，去除线状载体DNADNA两末端的两末端的55磷酸基团。磷酸基团。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性质粒碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性质粒DNADNA再环化再环化 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程 定向克隆法定向克隆法 当用当用两种两种不同的限制性内切酶（不同的限制性内切酶（BamH IBamH I和和EcoR IEcoR I）消化外源消化外源DNADNA时，可以产生带有非互补突时，可以产生带有非互补突出末

10、端的外源出末端的外源DNADNA片段，此片段可采用所谓的片段，此片段可采用所谓的定向定向克隆克隆（directional cloningdirectional cloning）法，即只以一个方法，即只以一个方向很容易的将其插入到同样用向很容易的将其插入到同样用BamH IBamH I和和EcoR IEcoR I进行进行消化而产生匹配粘端的载体中。消化而产生匹配粘端的载体中。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程PUC19EcoR Sac Kpn Sma BamH Xba Sal Pst Spn Hind GCGCCGCGCG3CTAG5 A 5 G C T 3AT CG C

11、G GCXba Sal Pst Spn Hind BamH 用连接酶连接质粒载体与靶用连接酶连接质粒载体与靶DNA外源外源DNADNAHind BamH Hind BamH 质粒载体中的定向克隆质粒载体中的定向克隆 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程平末端连接法平末端连接法 由由T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶催化连接酶催化，但属于，但属于低效低效反应反应。 平末端需具备平末端需具备4 4个条件：个条件： （1 1）极高浓度的）极高浓度的T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶；连接酶； （2 2）高浓度的平末端外源）高浓度的平末端外源DNADNA和质粒和质粒DNAD

12、NA； （3 3）低浓度（）低浓度（0.5m mol/L0.5m mol/L）的）的ATPATP； （4 4）不存在亚精胺一类的多胺。）不存在亚精胺一类的多胺。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程T4DNAT4DNA连接酶连接酶T4DNAT4DNA连接酶连接酶分子间连接分子间连接( (串联串联) )分子内连接分子内连接( (环化环化) )平末端连接平末端连接 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程同聚物加尾法同聚物加尾法利用利用末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶可催化可催化dNTPdNTP加到单链或双链加到单链或双链DNA DNA 3-OH3-OH

13、端的能力，在目的端的能力，在目的DNADNA和质粒载体上加入和质粒载体上加入互补同聚物互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。环重组分子。 由于由于polypoly（dAdA）同）同polypoly（dTdT），）， polypoly（dGdG）同）同polypoly（dCdC）不等长，重组不等长，重组DNADNA分子上便会留有缺口或裂口，需用分子上便会留有缺口或裂口，需用KlenowKlenow片片段去填补，然后用段去填补，然后用DNADNA连接酶封闭裂口。连接酶封闭裂口。 同聚物尾巴长度超过同聚物尾巴长

14、度超过1010个核苷酸，则碱基对结构相对稳定。个核苷酸，则碱基对结构相对稳定。未完全连接的重组体分子可直接导入受体细胞，由寄主细胞未完全连接的重组体分子可直接导入受体细胞，由寄主细胞内部的内部的DNADNA聚合酶和聚合酶和DNADNA连接酶进行修复。连接酶进行修复。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程AAAAAAAAAAAAAACTGCAGGGGGGGp CCCCCCT TTTTT TGGGGGGACGTCAAAAAAACCCCCC G转化适当的大肠杆菌菌住转化适当的大肠杆菌菌住选择抗生素抗性选择抗生素抗性转化过程中转化过程中DNA上的缺口为宿主酶所修复上的缺口为宿主酶所

15、修复,从而在从而在cDNA两端恢复两端恢复Pst 位点位点用用PstPst消化消化CTGCAACGTCpGGp用末端转移酶加用末端转移酶加(dG)(dG)残基残基CTGCAGGGGGGGGGGGGACGTCpGGpAAAAAAA以以Oligo(dT)Oligo(dT)作引物作引物合成合成cDNAcDNA第一链第一链TTTTTTTTTTTTTT合成合成cDNAcDNA第二链第二链TTTTTTTAAAAAAACCCCCCCCCCCC退火退火用末端转移酶加用末端转移酶加(dC)(dC)残基残基Pst Pst Pst Pst cDNA同聚物加尾法克隆双链同聚物加尾法克隆双链cDNAcDNA人工接头法人

16、工接头法 人工接头是人工接头是化学合成化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（的两个自相互补的核苷酸寡聚体（10-12bp10-12bp），而两个寡聚），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上体可形成带一个或一个以上限制酶切位点限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸片段。人工接的平末端双链寡核苷酸片段。人工接头的头的5-5-末端先用多核苷酸激酶处理使之末端先用多核苷酸激酶处理使之磷酸化磷酸化，在通过，在通过T4DNAT4DNA连接酶的作用使连接酶的作用使人工接头与待克隆的人工接头与待克隆的平末端平末端DNADNA片段连接起来。接着用适当的片段连接起来。接着用适当的限制酶消化限制酶消化具衔接具衔接物的物的D

17、NADNA分子和克隆载体分子，使二者都产生出彼此互补的分子和克隆载体分子，使二者都产生出彼此互补的粘性末端粘性末端，按照常规，按照常规的粘性末端连接法形成重组子。的粘性末端连接法形成重组子。 EcoRI Hpe BamHI Hpa AluI Hind Gene Engineering 基基 因因 工工 程程人工接头法连接人工接头法连接DNADNAT4DNAT4DNA连接酶连接酶CCAAGCTTGGGGTTCGAACCCCAAGCTTGGGGTTCGAACCCCAAGCTTGGGGTTCGAACC AGCTTGG ACCCCAGGTTCGAHind Hind AGCTT AATTCGA AAGC

18、TTGG TTCGAACCCCAAGCTTGGTTCGAAT4DNAT4DNA连接酶连接酶兼有同聚物加尾法和粘性末端加尾连接法的优点，可根据需要设计不同限兼有同聚物加尾法和粘性末端加尾连接法的优点，可根据需要设计不同限制酶切位点的人工接头，还可实现制酶切位点的人工接头，还可实现DNADNA片段的定向克隆。片段的定向克隆。缺点：如果待克隆的缺点：如果待克隆的DNA DNA 片段含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，片段含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，则会外源基因切成不同的片段。则会外源基因切成不同的片段。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程 加加DNADNA衔接物

19、连接法衔接物连接法 DNADNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡核苷酸，衔接物也是人工合成的一小段双链寡核苷酸，与人工接头不同的是与人工接头不同的是一头为平整末端一头为平整末端（与双链目的（与双链目的DNADNA平端连接），另一头带有某种限制酶的平端连接），另一头带有某种限制酶的粘性末粘性末端端（与载体的相应粘端连接）。它在与双链目的（与载体的相应粘端连接）。它在与双链目的DNADNA连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体DNADNA进行连接反应。进行连接反应。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程应用应用BamHDNABamHDN

20、A衔接物构建重组体分子衔接物构建重组体分子PPHOOHBamHBamH衔接物分子衔接物分子HOHOOHHOHOOHPP5HO-GATCCCCGGG-OH3 HO-GGGCCC-PPPHOOH外源外源DNADNA片段片段T4DNAT4DNA连接酶连接酶 ATP ATPHOHOOHOHHOPPOH载体载体BamHBamH局部消化局部消化连接连接重组体质粒重组体质粒粘性末端的粘性末端的5-5-P P被修饰成被修饰成5-5-OHOH，防止衔接物分子的粘性末端防止衔接物分子的粘性末端通过碱基间的配对作用形成二聚体，带有两个衔接物物的通过碱基间的配对作用形成二聚体，带有两个衔接物物的目的目的DNADNA分

21、子自身形成共价闭环分子或线状嵌合分子。分子自身形成共价闭环分子或线状嵌合分子。 Gene Engineering 基基 因因 工工 程程 其他转换末端形式连接法其他转换末端形式连接法 许多时候出现目的许多时候出现目的DNADNA片段的末端与载体片段的末端与载体DNADNA末端并不匹配末端并不匹配的情况，必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的主要的情况，必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的主要方式是将粘性末端修饰成平末端或将平末端修饰成互补粘性方式是将粘性末端修饰成平末端或将平末端修饰成互补粘性末端。末端。 常用常用3 3种方法种方法 部分补平部分补平33凹端：凹端：KlenowKlenow片段片段 完全补平完全补平33凹端：凹端：KlenowKlenow片段片段 去去 除除 3 3突出端：应用突出端：应用T4T4噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶特别强的聚