mofloXDP流式细胞仪基本原理以及应用

1、细胞研究必备的仪器细胞研究必备的仪器细胞成像、定位细胞成像、定位（单个细胞（单个细胞） 细胞定量测定细胞定量测定（群体细胞特征（群体细胞特征）分析型分析型：一个细胞的身世：我是谁：一个细胞的身世：我是谁混杂的细胞群激光激发标记在细胞上的荧光素Directly to waste仪器的电子系统收集荧光信号并处理 信号计算机工作站对信号进行收集和统计流式细胞仪是通过对目标细胞上的荧光信号进行识别流式细胞仪是通过对目标细胞上的荧光信号进行识别而实现对细胞的定量而实现对细胞的定量一个细胞的命运一个细胞的命运混杂的细胞群身份的鉴定识别和通过的速度分选是一个复杂的过程流式细胞仪是细胞组学的定量工具流式细胞仪

2、是细胞组学的定量工具可以做以下定量： 细胞相对定量（） 细胞绝对定量（细胞/l） 细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞）流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构=细胞大小=细胞粒度=细胞表面面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量=蛋白质含量细胞功能= 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原= 细胞活性= 细胞内细胞因子= 酶活性= 激素结合位点= 细胞受体流式细胞仪基本原理流式细胞仪基本原理通过激光激发高速流动的细胞或微粒所携带的荧光染料或荧光素，并检测由此产生各种光信号，如散射光、自发荧光、特异性荧光的强弱，来反映各项待检测指标。成功的流式实验需要三步走：下游实验,培养或者其他生物手

3、段验证u单细胞悬液制备u样本保存u荧光标记u设置对照单细胞悬液制备单细胞悬液制备样本浓度要求：建议105106/ml血样本 样本要求：EDTA、肝素、柠檬酸钠抗凝全血 凝血、溶血样本应当弃用 白细胞样本白细胞样本：需裂解去除红细胞 裂解液的选择：甲酸 作用强，适用于一般检测 氯化铵 作用温和，适用于低含量细胞 注意：温度过低会影响裂解效果 红细胞样本红细胞样本：PBS或生理盐水稀释1000倍 血小板样本血小板样本：避免使用肝素抗凝血， PBS或生理盐水稀释20倍 培养细胞l一般处理：消化分散成单细胞，过300目滤网去除细胞团块l易聚集的细胞：可在缓冲液中加13%的小牛血清或BSA或0.05%E

4、DTA 单细胞悬液制备单细胞悬液制备组织细胞组织细胞 脾细胞，在缓冲液中将血洗净，剪成数块，直接在300目滤网上研碎过筛 肝、肾组织及结肠癌等富含实质细胞的组织，于缓冲液中充分剪碎，细胞分散于缓冲液中，过100目滤网，再过300目滤网 肺、肠粘膜等结缔组织较多的组织，剪碎并用胰酶、胶原酶等消化分散 骨、软骨、心肌、骨骼肌、脑组织等，可尝试机械剪碎及酶消化后于培养液中静置贴壁分离细胞，但可用的细胞往往较少，最好进行原代培养 单细胞悬液制备单细胞悬液制备外周血样本：在不处理的情况下于4度存放35天，仍可用于大多数 表面分子标记检测。但做细胞绝对计数应在24h内检测固定：低浓度的甲醛或多聚甲醛固定（

5、1%）可用于培养细胞或已 分散成单细胞的组织来源样本的短期保存（80%），固定时 震荡逐滴加入，避免结块，12ml/样本，存放于-20度（1月）注意：已标记荧光的样本和对细胞活力有要求的样本应尽快检测， 以免荧光淬灭及细胞活力丧失样本保存样本保存荧光标记荧光标记表面抗原标记：抗体用量106cells/test 冻干粉可以0.51ug/106cells为起始量脂溶性染料：可直接进入细胞内细胞内抗原标记及水溶性染料：需要膜通透试剂处理 膜通透试剂的选择 甲醇：中等，可能导致部分蛋白变性 皂素：温和，对细胞形态影响小 Triton-X100：强烈，对细胞形态影响大 商品化试剂：含有上述多种成分，不同

6、组合用途不同荧光素的选择激发波长激发波长发射波长发射波长激光激光荧光通道荧光通道荧光素的选荧光素的选择择CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP FITC APC ECD PC5 PC770,000eps for 2hrs 如何设门1.远离碎片，便于圈门 2.分群不清晰，加大电压 软件去除粘细胞适合所有应用的细胞接收系统分选角度定位 4路分选Cyclone克隆分选装置支持任意厂家的标准 6, 24, 96, 384, 1536 微孔板, 客户定制的微孔板, 波片客户任意指定矩阵的细胞芯片，并且操作简单 Summit SoftwareWi

7、ndows XP 系统SUMMIT软件涵盖所有的数据和图形处理功能SUMMIT软件以数据库储存为基础，支持自动补偿，离线补偿，多文件分析报告等最先进流式软件性能SUMMIT软件完全开放安装，可以分析所有国际标准LMD/FCS数据，方便使用SUMMIT软件界面简单，易学易用SUMMIT软件独有单参数图颜色示踪功能软件对分选效果的影响 软件放大功能流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用支持最全面的生命科学研究内容免疫功能研究（包括淋巴细胞亚群分析、细胞绝对计数、细胞活化、细胞因子、调节性T细胞、树突细胞、抗原特异性T细胞、Th17细胞等）肿瘤相关研究（肿瘤相关基因表达、抗肿瘤药物作用机制及多药耐药等）细

8、胞周期和DNA倍体分析、细胞周期蛋白干细胞研究（干细胞的分离、鉴定、功能分析等）细胞治疗药物筛选、抗体研发，疫苗评估细胞凋亡及凋亡相关蛋白细胞增殖、转染效率检测磷酸化蛋白的检测及信号传导通路的研究细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞内pH值、细胞内钙流、膜电位）细胞多色分选0.0017%极低含量的肝癌细胞系HuH7干细胞分析分选。获取数量超过1300万细胞，CD133阳性细胞含量低于1/10万（0.0017%），总共收集到100多个细胞，直接注射裸鼠皮下进行成瘤观察Unpulished data shanghai极低含量的目标细胞（十万分之一）需要一次性海量获取样本细胞才能检测到和分选到淋巴细胞亚

9、群的分析和分选淋巴细胞亚群的分析和分选T T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)(CD3+)名名 称称功功 能能辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD8+CD28+抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8- 有调节功能的T细胞,

10、其表达 / T细胞受体(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+ 记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高活化活化T淋巴细胞淋巴细胞名名 称称功功 能能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+ CD25+ CD8+

11、CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味着HIV患者的预后较差CD19+CD23+ 活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞 自身免疫性疾病时降低, 而病毒感染时升高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 注意事项 1.裂红完全SSFS2.CD45/SS设门分选 CD44 FITC/CD133 PE细胞(肿瘤干细胞）从香港空运到上海的手术肿瘤切块，分离成单个细胞后进行染色、检测和分选MoFlo XDP，二军大分选后的细胞皮下注射研究干细胞

12、致瘤性Sorted CD44Sorted CD133两个月后结果：表达CD44的细胞的致瘤性强于表达CD133的细胞MoFlo XDP，二军大细胞周期分析细胞周期分析 / DNA含量分含量分析析G0/G1SG2/MG0：静止期，G1：DNA合成前期，S：DNA合成期G2：DNA合成后期，M：有丝分裂期推荐设门：注意事项：1.“细胞去哪里了”？2.固定必须用70%冰乙醇，固定时间2h以上3.乙醇清洗干净，否则影响RNase的效果细细胞凋胞凋亡亡细胞形态的变化细胞质膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻导致的细胞膜不对称性消失线粒体膜电位的改变蛋白水解酶Caspase酶 的活化核酸内切酶活化导致的DNA断裂凋亡

13、峰的检测ANNEXIN V/PIANNEXIN V/PI凋亡分析凋亡分析DNA链断裂膜PS外翻样本制备：样本制备： 1、未染细胞 2、单染细胞（建立凋亡模型，必须有凋亡群体存在，用于补偿调节） 3、实验样本 注意事项：注意事项： 1.PI1.PI毒性，一小时内测完毒性，一小时内测完 2.2.贴壁细胞消化和吹打时混匀，注意离心力和离心时间贴壁细胞消化和吹打时混匀，注意离心力和离心时间 3.3.不能固定，要在冰上操作不能固定，要在冰上操作 4.4.假阴性假阴性：并非所有凋亡细胞都会出现：并非所有凋亡细胞都会出现PSPS外翻外翻 5.5.假阳性假阳性：坏死细胞含少量：坏死细胞含少量PSPS；补体激活

14、细胞可能发生；补体激活细胞可能发生PSPS外外翻；血小板存在翻；血小板存在PSPS外翻；巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体外翻；巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，时，Annexin VAnnexin V检测也会阳性检测也会阳性 细胞增殖的检测与分析细胞增殖的检测与分析-CFSE-CFSE标记标记 羧基荧光素乙酰乙酸羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成带自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成带负电荷的荧光物质负电荷的荧光物质-CFSE。CFSE不可逆地通过偶联到细胞蛋白质上，随细不可逆地通过偶联到细胞蛋白质上，随细胞分裂平均分配胞分裂平均分配胞内活性氧水平的检测与分析胞内活性氧水平的检测与分析-DCFH-DA -DC