C8酶免疫技术

1、定义：定义：酶免疫技术是以酶标记抗体或抗原为酶免疫技术是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。主要试剂的一种标记免疫分析技术。应用：应用： 酶免疫技术酶免疫技术 应用日益广泛，是取代应用日益广泛，是取代放射免疫技术的主要方法之一。放射免疫技术的主要方法之一。第一节第一节 酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点l1.1.酶免疫技术是：酶免疫技术是：l酶催化底物反应的生物放大作用；酶催化底物反应的生物放大作用；l高度特异性、敏感性的抗原高度特异性、敏感性的抗原- -抗体反抗体反 应的一种检测方法。应的一种检测方法。l2.2.优点：优点：l灵敏度高、特异性强、准确性好；灵敏度高、特异性强、准

2、确性好；l酶标记试剂能够较长时间保持稳定；酶标记试剂能够较长时间保持稳定；l方法简单安全易行。方法简单安全易行。一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物（一）要求（一）要求酶活性高：酶活性高：与抗原、抗体结合与抗原、抗体结合, ,不影响抗原抗体的反应。不影响抗原抗体的反应。酶催化底物后产生的产物易于判定或检测酶催化底物后产生的产物易于判定或检测方法简单、敏感和重复性好。方法简单、敏感和重复性好。酶活性稳定；酶活性稳定；酶及其底物等对人体无危害，理化性质稳酶及其底物等对人体无危害，理化性质稳定，且价廉易得。定，且价廉易得。 （二）常用酶及其底物（二）常用酶及其底物1.1.辣根过氧化物酶（辣根过氧化物

3、酶（horseradish horseradish peroxidase,HRPperoxidase,HRP）常用的底物有以下几种：常用的底物有以下几种：（1 1）邻苯二胺（）邻苯二胺（orthophenylenediaminoorthophenylenediamino，OPDOPD）：经与酶反应后显橙黄色，作为底物，）：经与酶反应后显橙黄色，作为底物，优点优点：灵敏度高，比色方便，是：灵敏度高，比色方便，是ELISAELISA中应用中应用 最早的底物。最早的底物。缺点缺点：应用液稳定性差，配制后在：应用液稳定性差，配制后在1 1小时内使小时内使用，显色反应过程需避光，它还具致癌性。用，显色反

4、应过程需避光，它还具致癌性。24H SO（2 2）四甲基联苯胺）四甲基联苯胺（3,33,3,5,5,5,5tetramethylbenzidine,TMBtetramethylbenzidine,TMB）: :TMB + TMB + 酶作用后酶作用后蓝色，便于目测观察结果。蓝色，便于目测观察结果。优点优点：稳定性好，成色反应无需避光，无致突变：稳定性好，成色反应无需避光，无致突变作用等，是目前作用等，是目前ELISAELISA中应用最广泛的底物。中应用最广泛的底物。缺点缺点：是水溶性差。：是水溶性差。（3 3）其他：）其他：5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸也是常用之也是常用之HRPHRP底物。底物

5、。 24H SO2.2.碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,APalkaline phosphatase,AP）应用应用APAP系统的系统的ELISAELISA测定敏感性高于使用测定敏感性高于使用HRPHRP者。者。APAP不易获得高纯制品，稳定性及酶不易获得高纯制品，稳定性及酶标记物的吸收率低于标记物的吸收率低于HRPHRP，且价格较高，故，且价格较高，故应用不如应用不如HRPHRP普及。普及。3.-3.-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-galactosidase-galactosidase，-GalGal）。）。 因人血中缺乏此酶，不易受到内源性酶的因人血中缺乏此酶

6、，不易受到内源性酶的干扰，因此也常用于均相酶免疫测定。干扰，因此也常用于均相酶免疫测定。 二、酶标记抗体或抗原二、酶标记抗体或抗原1 1、酶标记的抗体或抗原也称为、酶标记的抗体或抗原也称为结合物结合物（conjugateconjugate）是酶免疫技术的关键试剂。）是酶免疫技术的关键试剂。2 2、高质量的酶标记、高质量的酶标记AbAb（AgAg）与）与酶、酶、AbAb（AgAg）等原材料的特性及制备方法密切相关等原材料的特性及制备方法密切相关。3 3、酶标记物的、酶标记物的AgAg要求纯度高，要求纯度高，AgAg性完整（半性完整（半AgAg需先与大分子载体蛋白交联）；需先与大分子载体蛋白交联）

7、；4 4、AbAb需特异性好、效价高、亲和力强以及比需特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，还要能批量生产和易于分离纯活性较高，还要能批量生产和易于分离纯化。化。5 5、目前根据要求选用单克隆抗体、多克隆抗、目前根据要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的体经纯化的IgIg组份、组份、IgIg的的FabFab等。等。 制备酶标记物时，所用的方法应用：制备酶标记物时，所用的方法应用： 方法简单，且重复性好方法简单，且重复性好 标记反应不影响酶和抗体（抗原）的标记反应不影响酶和抗体（抗原）的 活性活性 应避免酶、抗体（抗原）以及酶标记应避免酶、抗体（抗原）以及酶标记 物各自形成集合物物各自形成集

8、合物 标记反应易于控制等。标记反应易于控制等。 常用的抗体（抗原）酶标记方法有；常用的抗体（抗原）酶标记方法有； 交联法和直接法两种。交联法和直接法两种。交联法交联法是以双功能交联剂为是以双功能交联剂为“桥桥”，酶和抗体，酶和抗体（抗原）连接（抗原）连接结合物；结合物；直接法直接法是用过碘酸钠活化酶蛋白分子是用过碘酸钠活化酶蛋白分子再与抗体再与抗体（抗原）结合。（抗原）结合。 但该法仅适用于含糖蛋白分子的酶（如但该法仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRPHRP）标记物制备。标记物制备。 以以HRPHRP标记抗体为例分别介绍两种方法的基本原理：标记抗体为例分别介绍两种方法的基本原理：1.1.戊二醛交

9、联法戊二醛交联法 该法有一步法和两步法两种：该法有一步法和两步法两种：一步法：一步法：将将HRPHRP和抗体蛋白质和抗体蛋白质 + + 戊二醛同时反应连接而成；戊二醛同时反应连接而成； 二步法：二步法：HRPHRP（有一定比例）（有一定比例）+ +戊二醛反应连接戊二醛反应连接 HRP-HRP-戊二戊二醛结合物醛结合物经透析除去多余未结合的戊二醛经透析除去多余未结合的戊二醛加加入抗体蛋入抗体蛋 + + 戊二醛的另一醛基交联反应戊二醛的另一醛基交联反应制成制成HRP-HRP-抗体标记物。抗体标记物。2.2.过碘酸钠法过碘酸钠法 在过碘酸钠（在过碘酸钠（NaIO4NaIO4）作用下）作用下多糖羟基多

10、糖羟基被氧化成活泼的醛基被氧化成活泼的醛基即可与抗体蛋白中即可与抗体蛋白中的游离氨基交联的游离氨基交联再经硼氢化钠还原终止再经硼氢化钠还原终止反应反应即得到稳定的酶标结合物。即得到稳定的酶标结合物。3.3.标记抗体的纯化与鉴定标记抗体的纯化与鉴定 三、固体载体三、固体载体（一）固相载体的要求（一）固相载体的要求1 1、固相载体应与抗体（抗原）有高的结合容、固相载体应与抗体（抗原）有高的结合容 量，且稳定极少脱落；量，且稳定极少脱落；2 2、生物大分子固相化后、生物大分子固相化后不影响活性不影响活性反应充分。反应充分。3 3、固相化方法应简便易行、快速经济。、固相化方法应简便易行、快速经济。 （

11、二）固相载体的种类和选择（二）固相载体的种类和选择1.1.塑料制品塑料制品 抗体抗体 + + 抗原抗原非共价或物理吸附机制非共价或物理吸附机制固固相载体表面。相载体表面。常用固相载体：常用固相载体： 聚苯乙烯聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板制成的小试管、小珠和微量反应板2.2.微颗粒微颗粒 此类固相载体系由高分子单体聚合成的微此类固相载体系由高分子单体聚合成的微球或颗粒。球或颗粒。 直径多为微米直径多为微米(m),(m), 易于抗体易于抗体( (抗原抗原) )形成化学偶联形成化学偶联, ,且结合容量大且结合容量大. .3.3.膜载体膜载体 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜(nitrocellul

12、ose NC)(nitrocellulose NC)、玻璃纤、玻璃纤维素膜及等微孔滤膜维素膜及等微孔滤膜. . 它们也是通过非共价键吸附抗体它们也是通过非共价键吸附抗体( (抗原抗原) )但但吸附能力强吸附能力强, , 故已广泛应用于定性或半定量斑故已广泛应用于定性或半定量斑点点ELISAELISA的固相载体。的固相载体。 （三）、包被与封闭（三）、包被与封闭将抗原或抗体固相化的过程称为包被将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating).(coating). 常用的聚苯乙烯固相载体常用的聚苯乙烯固相载体( (如如ELISAELISA板板) )即多采即多采用用吸附方式吸附方式包被抗原或抗体包

13、被抗原或抗体. .第二节 酶免疫技术的分类1 1、酶免疫技术是利用酶的高效催化和放大作用、酶免疫技术是利用酶的高效催化和放大作用与特异性抗原与特异性抗原- -抗体反应相结合而建立的一种抗体反应相结合而建立的一种标记免疫技术。标记免疫技术。2 2、酶免疫技术组成：、酶免疫技术组成：首先是首先是Ag+AbAg+Ab免疫反应免疫反应复合物（其中包含复合物（其中包含有酶标抗原或抗体的参与）；有酶标抗原或抗体的参与）；加入酶作用底物加入酶作用底物酶标中酶标中Ag+AbAg+Ab的酶即催化的酶即催化其发生呈色反应。其发生呈色反应。产物的颜色与产物的颜色与Ag+AbAg+Ab复合物中酶标记物的酶复合物中酶标

14、记物的酶活性相关，活性相关，因此可以通过测定酶活性来确因此可以通过测定酶活性来确定待检抗原或抗体的存在或含量。定待检抗原或抗体的存在或含量。 酶免疫测定（酶免疫测定（EIAEIA）是利用酶标记抗原或抗是利用酶标记抗原或抗体做标记物，用于检测体做标记物，用于检测液体样品液体样品中可溶性中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。抗原或抗体含量的微量分析技术。EIAEIA一般一般可分为均相和异相两大类。可分为均相和异相两大类。 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术 一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定 均相酶免疫测定属于竞争结合分析方法均相酶免疫测定属于竞争结合分析方法. . 其原理是其原理是: : A

15、g Ag* * + Ab + Ab AgAg* *AbAb + + Ag Ag AgAb AgAb 不需分离不需分离, ,直接测定反应系统中的总酶活直接测定反应系统中的总酶活性的变化性的变化, ,即可推算出被测样品中的即可推算出被测样品中的AgAg的含量。的含量。EAb( (一一) )酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术 酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术(enzyme-mutiplied (enzyme-mutiplied immunoassay technigue, EMIT)immunoassay technigue, EMIT)是最早且应用是最早且应用最广的均相最广的均相EIAEIA

16、，最终测得的酶活性随着反应体系中未最终测得的酶活性随着反应体系中未标记抗原标记抗原(Ag)(Ag)浓度的升高而增强。浓度的升高而增强。（二）克隆酶供体免疫分析（二）克隆酶供体免疫分析 克隆酶供体免疫分析（克隆酶供体免疫分析（cloned enzyme donor cloned enzyme donor immunoassayimmunoassay，CEDIACEDIA）的）的基本原理基本原理是：是： DNADNA重组技术可分别合成某种功能性酶（如重组技术可分别合成某种功能性酶（如B-D-B-D-半乳糖苷酶）分子的两个片段，半乳糖苷酶）分子的两个片段，大片段称为大片段称为酶受体（酶受体（enzy

17、me acceptorenzyme acceptor，EAEA），小片段称为酶），小片段称为酶供体（供体（enzyme donorenzyme donor，EDED）。）。 单独的单独的EAEA和和EDED均无酶活性，但在一定条件下均无酶活性，但在一定条件下可结合形成具酶活性的四聚体。可结合形成具酶活性的四聚体。 EDAgEDAg最终测得的酶活力的大小与标本抗最终测得的酶活力的大小与标本抗原原(Ag)(Ag)含量成正比。含量成正比。 应用：应用：1 1、用于小分子激素和半抗原、用于小分子激素和半抗原( (如药物如药物) )的测的测 定。定。2 2、优点：它由于勿需分离，操作简单、优点：它由于勿

18、需分离，操作简单, ,还还易于自动化分析。易于自动化分析。3 3、缺点：是易受干扰（、缺点：是易受干扰（样品中非特异的内样品中非特异的内源性酶源性酶, ,酶抑制剂及交叉反应物的）酶抑制剂及交叉反应物的） 采用竞争性结合分析原理采用竞争性结合分析原理, ,灵敏度不灵敏度不及异向酶免疫测定。及异向酶免疫测定。二、异相酶免疫测定二、异相酶免疫测定 异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术，免疫测定技术，基本原理：基本原理：1 1、抗原抗体反应平衡后、抗原抗体反应平衡后需要分离游离和结合需要分离游离和结合形成复合物的酶标记物，形成复合物的酶标记物，2

19、 2、然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，、然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算出样品中待测抗原再推算出样品中待测抗原( (或抗体或抗体) )的含量。的含量。 依据测定方法是否采用固相材料以吸附抗依据测定方法是否采用固相材料以吸附抗原或抗体，又分为液相和固相酶免疫测定两原或抗体，又分为液相和固相酶免疫测定两类类. .。( (一一) ) 异相液相酶免疫测定特点异相液相酶免疫测定特点 用于检测样品中极微量的短肽用于检测样品中极微量的短肽激素和某些药物等激素和某些药物等小分子半抗原小分子半抗原; ; 酶标记物具更好的稳定性酶标记物具更好的稳定性, ,且且无放射性污染无放射性污染, ,故近年

20、来有取代放故近年来有取代放射免疫测定的趋势射免疫测定的趋势. . 平衡法和非平衡法两种平衡法和非平衡法两种( (二二) )固相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定特点：固相酶免疫测定特点：(solid phase enzymeimmunoassay(solid phase enzymeimmunoassay，SPEIA),SPEIA),1 1、利用、利用固相支持物作载体固相支持物作载体预先吸附抗原或预先吸附抗原或 抗体；抗体；2 2、使测定时的免疫反应在其表面进行并形成、使测定时的免疫反应在其表面进行并形成 抗原抗体复合物；抗原抗体复合物；3 3、洗弃反应液中无光物质并加入酶底物后、洗弃反应

21、液中无光物质并加入酶底物后, ,4 4、通过测定固相载体上的酶标记物催化底物、通过测定固相载体上的酶标记物催化底物 生成的有色产物生成的有色产物, ,确定样品中抗原或抗体确定样品中抗原或抗体 的含量。的含量。第三节第三节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)于于19711971年分别年分别由瑞典学者由瑞典学者EngrallEngrall和和Perlman,Perlman,荷兰学者荷兰学者VanWeemanVanWeeman和和SchuursSchuurs报道报道. . 它开创了运用酶标记免疫技术进行液体标它开创了运用酶标记免疫技术进行液

22、体标本中微量物质测定的实验方法。本中微量物质测定的实验方法。 基本原理：基本原理：1 1、把抗原或抗体预先结合到固相载体表面、把抗原或抗体预先结合到固相载体表面 ( (在不损坏其免疫活性的条件下在不损坏其免疫活性的条件下););2 2、测定时、测定时, ,将受检样品将受检样品( (含带测抗体或抗原含带测抗体或抗原) )和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物抗体复合物; ;3 3、反应终止时、反应终止时, ,固相载体上的酶标抗原或抗固相载体上的酶标抗原或抗 体被结合量体被结合量(

23、(免疫复合物免疫复合物) )即与标本中待检即与标本中待检 抗体或抗原的量成一定比例抗体或抗原的量成一定比例; ;4 4、经洗涤去除反应液中其它物质、经洗涤去除反应液中其它物质, ,加入酶底加入酶底 物后物后, ,5 5、底物即被固相载体上的酶催化变为有色产、底物即被固相载体上的酶催化变为有色产 物物, ,6 6、最后通过定性或定量分析有色产物量即可、最后通过定性或定量分析有色产物量即可 确定样品中待测物质含量。确定样品中待测物质含量。二、方法类型二、方法类型以下举例介绍几种常用的检测以下举例介绍几种常用的检测AgAg方法。方法。1 1、双抗体夹心法、双抗体夹心法 双抗体夹心法，属非竞争结合测定

24、。双抗体夹心法，属非竞争结合测定。 它是它是检测抗原检测抗原最常用的最常用的ELISAELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 基本工作原理：基本工作原理：1 1、是利用连接于固相载体上的、是利用连接于固相载体上的抗体抗体和和酶标抗体酶标抗体可分别与样品中被检测可分别与样品中被检测抗原抗原结合，结合，形成固相抗形成固相抗体体- -抗原抗原- -酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物。2 2、由于固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗、由于固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗原

25、是过量的。原是过量的。 因此复合物的形成量与待检抗原的含量因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比。成正比。3 3、测定复合物中酶作用于加入的底物后生成的、测定复合物中酶作用于加入的底物后生成的有色物质量有色物质量(OD(OD值值) )，即可确定待检杭原含量，即可确定待检杭原含量双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、双位点一步法、双位点一步法3.3.竞争法竞争法 特点：特点：酶标酶标抗原抗原与样品或标准品中的与样品或标准品中的非标记抗原非标记抗原与与固固相抗体相抗体有相同结合的能力有相同结合的能力反应中反应中, ,固相抗体和酶

26、标抗原是固相抗体和酶标抗原是固定限量固定限量反应后反应后, ,结合于固相载体上的复合物中被测定结合于固相载体上的复合物中被测定的酶标抗原的量的酶标抗原的量( (酶活性酶活性) )与样品中非标记抗原与样品中非标记抗原的浓度成的浓度成反比反比. .竞争法测抗原竞争法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包

27、被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E以下举例介绍几种常用的检测以下举例介绍几种常用的检测AbAb方法。方法。1.1.间接法间接法 此法是测定抗体最常用的方法，此法是测定抗体最常用的方法，属非竞争结合试验。属非竞争结合试验。原理：原理：（1 1）将）将抗原抗原联接到联接到固相载体固相载体上，样品中待检上，样品中待检抗体与抗体与抗原抗原结合成结合成固相抗原固相抗原- -受检抗体复合物受检抗体复合物；（2 2）再用）再用酶标二抗酶标二抗与固相免疫与固相免疫复合物中的抗体复合物中的抗体结合，结合，形成形成固相抗原固相抗原-

28、 -受检抗体受检抗体- -酶标二抗复合物酶标二抗复合物；（3 3）测定加底物后的显色程度，确定待检抗体含量）测定加底物后的显色程度，确定待检抗体含量 间接法：采用的酶标二抗是针对一类免疫球间接法：采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子蛋白分子( (如抗人如抗人IgG),IgG),具有更广的通用性。具有更广的通用性。 间接法测抗体间接法测抗体- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E抗原包被抗原包被阳性血清阳性血清(含抗体含抗体)洗涤洗涤加酶作用底物加酶作用底物加终止液加终止液竞争法竞争法原理：原理：类似检测抗原的竞争法类似检测抗原的竞争法 应用应用：乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝

29、炎病毒核心抗体(HBcAb)(HBcAb)和乙和乙型肝炎病毒型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb)(HBeAb)的检测的检测 3 3、竞争法测抗体、竞争法测抗体E EE EE E2 2、加待检抗、加待检抗体与酶标抗体体与酶标抗体竞争与抗原竞争与抗原结合结合3 3、加酶作、加酶作用的底物，用的底物，显色强弱与显色强弱与待测抗体成待测抗体成反比反比3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色，的底物显色，显色强弱与显色强弱与待测抗体成待测抗体成反比反比1 1、已知抗原包、已知抗原包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测抗体、加待测抗体和酶标抗原，和酶标

30、抗原，待测抗体与固待测抗体与固相抗体竞争与相抗体竞争与酶标抗原结合酶标抗原结合E EE EE EE E4.4.捕获法捕获法 （亦称反向间接法）（亦称反向间接法）ELISAELISA， 主要用于血清中某种抗体亚型成分主要用于血清中某种抗体亚型成分（如（如IgMIgM）的测定。）的测定。捕获法原理捕获法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性