生物大分子与分子生物学细胞凋亡及其检测

1、会计学1生物大分子与分子生物学细胞凋亡及其生物大分子与分子生物学细胞凋亡及其检测检测 细 胞 程 序 性 死 亡 ( P r o g r a m m e d c e l l death,PCD)的概念是1956年提出的，PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡(Apoptosis)则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏

2、死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。凋亡概念的形成1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞这些的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段（1972-1987）1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。2

3、）染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。3） RNA/蛋白质大分子的合成。4）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。 5）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。细胞凋亡的分子生物学研究阶段，最近几年研究热点1）与细胞凋亡的相关基因及其调控2）细胞凋亡的信号转导3）与细胞凋亡的各种分子及其相互作用4) 细胞凋亡的临床应用基础研究阶段第一节 概述一、细胞凋亡概念和特征 细胞坏死（necrosis）是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的病理性死亡。其特点是: 引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。能量代谢

4、下降膜通透性增加细胞水肿细胞器破裂，细胞溶解，DNA不断裂内含物释放引起炎症反应。 细胞凋亡:是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的死亡，是受基因严格调控的.凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解细胞和细胞器浓缩而不裂解染色体DNA断裂和形成凋亡小体细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。胸腺细胞正常凋亡Ladder Pattern of Apoptotic Cells第二节 与细胞凋亡有关的基因和蛋白质Caspase的含义表现在两个方面：（）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团。（）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基

5、与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。 是一类促进细胞凋亡的蛋白水解酶，在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞凋亡。 人体caspase基因是细胞凋亡的活化基因。 caspase 酶原 前结构域 + 大亚基 + 小亚基 大 异二聚体 小 大 大 异四聚体 活性形式 小 小Crystal Structures of Human Caspases Structure of Caspase-7 with Inhibitor Caspase 作用： 是一类蛋白水解酶，可特异水解底物蛋白分子中天冬氨酸残基羧基侧的肽

6、键，且对此Asp前面的4个氨基酸残基有要求。从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。 N A-B-C-D-Asp-X C 不同的Caspase对ABCD种类要求不同。 Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。其中caspase3的作用最重要。但并非所有的凋亡过程都有caspase的参与。3 Caspase的底物1、细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白等十 几种蛋白。2、与DNA损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复。 如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制

7、相关蛋白。3、激活DNA酶，促进DNA断裂。二、死亡受体及相关蛋白 是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：* 死亡配体（细胞外）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活caspase 诱导细胞凋亡Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated death domain protein Apoptosis (2) TRADD（TNFR-1 相关死亡结构域蛋白） 从TNFR-1接受死亡信号，然后传递给FADD. This protein can also interact with receptor FAS,

8、and is involved in the Fas-induced cell death pathway (3) RIP(受体相互作用蛋白，Receptor interaction protein, RIP） RIP能与Fas和TNFR-1两种受体结合。其C-端是死亡结构域，N-端与FADD蛋白具有同源性。RIP在细胞中的过表达可引起细胞凋亡。三、凋亡蛋白酶激活因子类（apoptosis protease activation factor, Apaf） 是一类促进细胞凋亡的蛋白因子，参与细胞凋亡的线粒体信息传递途经。 细胞凋亡与线粒体膜电位及通透性改变有关。凡是诱导细胞凋亡的因素，都可使线

9、粒体的膜电位下降，膜通透性增加，线粒体膜通透性转运孔（MPT）开放，释放出多种可激活caspase的蛋白因子，包括细胞色素c（Cytc ），凋亡诱导因子(AIF)等。 凋亡诱导因子是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白，具有双重功能。在细胞正常的生理状态下，AIF作为线粒体氧化还原酶，能催化细胞色素c（Cyt-c）和NAD之间的电子传递，当细胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIF从 线 粒 体 转 位 到 核 内 ， 与 线 粒 体 蛋 白 质endonuclease G (Endo G)一起引起细胞染色体的凝聚和DNA大的片段化。 A I F 引 起 的 细 胞 凋 亡 不 依

10、 赖 于c aspase的 活 性， 但 A I F 和 C y t -c/caspase/CAD（caspase-activated DNAase）诱导的凋亡通路之间并不是完全独立的，胞浆中的AIF可以使线粒体 释 放 更 多 的 C y t - c ， 而 活 化 的caspase也能使线粒体释放AIF因子。 apoptosis-inducing factor 四、bcl-2家族 Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的

11、结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类，一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。 虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道 ，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。bcl-2 二聚体抑制凋亡，促

12、进细胞增殖bax 二聚体促进凋亡p53 促进 bax 蛋白的合成第三节 细胞凋亡通路 现认为细胞凋亡过程大体可分为3个阶段; 诱导期( induction phase)、效应期(effector phase) 和降解期(degradation phase) 。 各种不同的内、外界刺激经相应受体或目前尚未清楚的途径激发凋亡信号传导, 通过效应分子相互作用引起caspase 家族的级联反应,降解各种细胞内底物, 随之出现细胞凋亡现象。目前发现细胞凋亡有3条通路：死亡受体通路线粒体通路内质网通路一、细胞凋亡的三条通路Fasassociated protein withdeath domainTNF

13、receptor-1associated death domain protein Apoptosis第四节 细胞凋亡的检测一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1、光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(是一种高级的荧光显微镜 )一般以细胞核染色质的形态学改变

14、为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apoptosis nucle

15、i）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针

16、，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存

17、在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)m的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，488nm激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞

18、膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。四、DNA片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300kbp长的DNA大片段, 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段。 大分子染色体DNA片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。其不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术。 180200bp整数倍的寡核苷酸片段在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染

19、色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。五、末端转移酶标记技术 -TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal - deoxynucleotidyl t

20、ransferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。凋亡癌细胞胞核见紫蓝色阳性颗粒TUNEL法 TUNEL技术检测BAK基因过表达后癌细胞凋亡 六、Caspase-3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1、Western blot 分析 分析Procaspase-3，活化的Cas