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文档简介

1、WORD格式1 、问:请问有人养过 CHO细胞吗?文献报道说用 DMEM培养基来养,但我不太清楚具体是高糖还是低 糖?参考见解: CHO细胞用高糖 DMEM养就可以了,比较好养, 10%血清,小牛和胎牛都可以,长得比较慢, 跟你所用的血清有一定的关系,大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养,感觉如果在玻璃板 上养而且不包被的话,好像细胞不易伸展开来。2 、问:要转染钾通道 pcDNA3.1 入细胞,是选 cho 细胞呢还是 hek293 细胞? cho 细胞转染效率高吗? 参考见解:表达一个蛋白的时候,首先要确认你的蛋白确实表达了,因为有很多原因可以导致蛋白表达出 问题(质粒序列有错误

2、,质粒纯度低,表达的蛋白不稳定,转染效率太低等)。所以在做任何功能性实验 之前,必须要先确认蛋白的表达,通常的实验有:( 1)采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗,比较贵。但直观,可以确定转染效率,采用好的显微镜时,可 以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。( 2) WESTERN-BLO。T可以确认表达的蛋白分子量,以及表达的量。但不直观。有可DNA( 3)构建一个 N或 C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间,同时携带的荧光蛋(通常使用GFP)能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率,蛋白在细胞中的位置等。当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变,所以如果你的蛋白有表达但没有功能,

3、首先要做一个 测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多!3、问:由于我要用 CHO细胞生产基因工程抗体,用什么培养基能够很好的使之良好的生长参考见解:培养 CHO细胞最好用 F12,并且由于 F12 中加入了一些微量元素与无机离子,因此可以在血 清很少的情况下应用,是无血清培养中常用的基础培养基,特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们 的前辈曾用 F12 在无血清的条件下成功的克隆出 CHO细胞。无血清培养 CHO细胞有两种方法:一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基(好像 HyClone 就有);第二种方法实际上是有血清培养,只不过血

4、清浓度很低罢了,可以近似的认为无血 清。在第二种方法里,又可以分出两条途径:你可以分步进行,也可以一步到位。分步法是,CHO细胞先在含 10血清的常规培养基里培养,再到含5血清的培养基里培养,再到含 2.5 血清的培养基里培养,依此类推,培养基里的血清不断下降,直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤,直接由起点的血清浓度到终点浓度。4、问:我要做稳定转染,表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1,没有插入其他的基因或者 tag 。现准备转染 CHO细胞。就相关问题想问问:有的文献上没有署名 K1 或是 DHFR,普通所写的

5、CHO细胞是指那种?野生型 CHO细胞又是指的哪种?这三种细胞是不是因为 CHO-K1和 CHO/DHFR有- 扩增基因 GS和 DHFR,可以更为有效的扩增进而表 达,比野生型 CHO在转染中更起作用?如果就我的实验要求, CHO-K1或者 CHO/DHFR更- 加适合,那么转染 CHO-K1是不是可以直接转染?而转染 CHO-DHFR需- 要和携带 DHFR-的标记质粒共转染?参考见解:做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的,这个载体同时可以过表达一个抗性基因, 如果载体整和到基因组上,这个抗性已经能够克服筛选压力,而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表 达。( 1 )野生型 CH

6、O就是(2)CHO DHFR-是指缺陷型细胞,作为筛选标记(3)你用 pc 3.1 的话, 可以直接转染 CHO-K1,加 G418筛选即可 .5 、问:最近作试验需要用到 CHO细胞,老师从广西带回两瓶,本来用的是DMEM培养液,由于我没有接触过细胞这方面的知识,上网查了下培养液,说 1640 就可以,就仓促用了 1640,两天过去了贴壁很 不好,估计是要完了,求救。参考见解 1:( 1)带回来的细胞瓶汇合度大概多少?一般送人的细胞汇合度大概80 90,且瓶里加满培养液,再包装。细胞生长旺盛,便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置,细胞接触不到培养液而死亡或 活力下降。培养时应该分瓶

7、培养。我想你应该分瓶了吧,我们一般 1:3 分瓶。不分瓶培养可想而知了。( 2)如果上述没错的话,准备好正确的完全培养液,将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集,合并一下, 铺底大概 30。正常培养。( 3)关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。因为这细胞已很常见。方法正确不存在长不好的问题。除 非你的老师带回来的细胞存在问题。参考见解 2:37 度预热胰酶,吸除培养瓶中的培养液, PBS(无钙镁)洗涤细胞 1次后,加入少量胰酶, 覆盖细胞即可。轻轻摇动(前后左右)。镜下观察细胞状态,一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化(防 止过渡消化)。加入完全培养液(必须含胎牛血清)终止消化反应。湾头吸管顺序吹

8、打细胞,小心避免产 生气泡(对细胞有害)。镜下观察细胞,细胞分散即可后续操作。如果是新手,保留上清以防不测,别倒 掉。6、问:最近要养 CHO细胞, 要作些准备 , 但不知道其培养也是什么 , 谢谢参考见解:这是一篇已发表的 CHO细胞培养的方法 .CHO细胞培养: CHO细胞株置于 RPMI1640培养基中,内含 10%灭活小牛血清,青霉素 100IU/mL,链霉素 100IU/mL,置于 37, 5%CO2的培养箱(德国 Heraeus)中培养。每隔 48h 换培液,当单层培养细胞汇合以后,用 0.25%胰蛋白酶消化,传代培养。将培养瓶中的CHO细胞按 1105/mL传代移入培养板中,待进

9、入对数生长期后(约24h )加药。这是细胞的供给源 :CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供。7、问:这两个月, CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去,同期转瓶生长正常,基本排除细 胞及培养基的问题,换罐做也出现同种现象,可排除反应器问题。与曾经在此罐上正常生长的一批相比, 只是接入培养液体积由 1.5 升该为 0.8 升,其他条件均相同,反应器控制系统无异常。不知问题到底出在 什么地方,恳请各位不吝赐教!不胜感激!参考见解:根据我自己的经验,如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话,试试一下几点:( 1 )接种时留一些细胞悬液,种回到方瓶或转瓶中,用与大罐相同的培养基

10、同时培养,观察48 小时内的生长情况,如果方瓶长势良好而罐子有问题,那就是操作的问题了( 2)不知道你的罐子 800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率,只看仪表显示是不够的,有时液位 太低可能探测到的不是真实值,你可以在接种前用水试试,把各种条件设的极端一些,容易发现问题( 3)有可能的话再做一次 1.5L 培养,看能否重现 6 月的结果,因为你说所有条件都一样可能是不准确的, 有疏漏的地方8、问:我培养的 cho 细胞, 在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好, 形态也很正常 ,但是接入转瓶后贴壁情况很差 , 不伸展或伸展需要的时间很长 . 请问这主要是什么原因 ?参考见解:我觉得可能的原

11、因有如下几点:( 1)细胞本身贴壁生长的能力较弱,一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿,这样的话,就选择 塑料器皿好了。其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的,清洗干净,泡酸,冲洗干净,凉干之后,射线照射消毒或者就是紫外消毒也行,我们实验室就这样重复用培养板,没有什么问题。当然,太旧的还是扔了好了。( 2)培养液 PH不好也会影响贴壁,配的时候加好缓冲试剂,不嫌麻烦的话调定PH在 7.2 左右。使用时间较长的培养液由于在空气中暴露时间长, ph 会有变化( 3)消化时候处理不合适,比如胰酶消化过久,有EDTA的话,去除不干净也影响贴壁的。消化完了之后要吸干净消化液,用培养液漂洗细胞,或者吹下

12、来之后离心,换加新鲜培养液( 4 )血清也可能影响贴壁,我观察过,细胞在胎牛血清中贴壁明显快于新生牛血清,尤其是Hyclone 的血清,不过很贵试试吧,有耐心点,等等它总会铺展开的9、问:最近我养 CHO细胞,是从别人那里得来得。给我得时候细胞有一半是圆形一半是梭行的。但是养 着养着就大部分成圆形,而且有的像荷包蛋一样,而那些还是梭形的细胞里面出现了空泡一样的东西,还 有渐渐像融化了一样。是什么原因,我一直很头疼,不知道该怎么办,下面的实验无法进行,苦恼啊! 参考见解:听您的描述估计很可能是支原体污染。建议马上丢弃该细胞,因为支原体污染很难去除,为避免影响您实验室其他的细胞操作一定不要犹豫。您 可以重新索取或购买状态好的 CHO细胞。10、问:由于接种密度稍低一些, CHO细胞在 2L 转瓶中培养 5 天左右很难消化下来

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