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文档简介

1、第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacylamide Gel Electrophoresis,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺(Acr)和和交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在在催化剂催化剂过硫酸铵过硫酸铵( 或 维 生 素或 维 生 素 B 2 ) 和和 加 速 剂加 速 剂 四 甲 基 乙 二 胺四 甲 基 乙 二 胺(TEMED)的作用下聚合,并联结成三维网)的作用下聚合,并联结成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。1.

2、按其电泳装置和凝胶的形状可分为:按其电泳装置和凝胶的形状可分为:垂直管状电泳(圆盘电泳)垂直管状电泳(圆盘电泳)垂直板型电泳垂直板型电泳一、分类:一、分类:2.按其凝胶的组成系统可分为按其凝胶的组成系统可分为 连续凝胶电泳:连续凝胶电泳:整个电泳体系中所用的缓冲整个电泳体系中所用的缓冲液成分、液成分、pH、凝胶孔径都相同、凝胶孔径都相同 不连续凝胶电泳:不连续凝胶电泳:在电泳体系中采用两种以在电泳体系中采用两种以上的缓冲液、上的缓冲液、pH值和孔径值和孔径 梯度凝胶电泳:梯度凝胶电泳:采用梯度混合装置,使制得采用梯度混合装置,使制得的凝胶由上至下孔径逐渐减小的凝胶由上至下孔径逐渐减小(即凝胶浓

3、度由上即凝胶浓度由上至下逐渐增高至下逐渐增高)。梯度凝胶电泳主要适宜于测定。梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的相对分子质量。球蛋白的相对分子质量。 SDS-凝胶电泳:凝胶电泳:在聚丙烯酰胺凝胶中加入在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)二、凝胶聚合的原理及有关特性二、凝胶聚合的原理及有关特性1聚合反应聚合反应凝胶的聚合常用凝胶的聚合常用过硫酸铵过硫酸铵(AP)为催化剂为催化剂,四甲四甲基乙二胺基乙二胺(TEMED)为加速剂为加速剂。此外,核黄素亦可。此外,核黄素亦可为催化剂,聚合需光照,故使用不多。为催化剂,聚合需光照,故使用不多。2凝胶的有关性质凝胶的有关性质(1)凝胶

4、性能与总浓度及交联度的关系)凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、黏度和聚合程度取决凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、黏度和聚合程度取决于凝胶浓度和交联度。于凝胶浓度和交联度。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度数称为凝胶浓度(T)。 T(%)=Acr(g)+Bis(g)/V(ml)100%凝胶溶液中,交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度凝胶溶液中,交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度(C)。 C(%)=Bis/(Acr+Bis)100%(2)凝胶浓度与孔径的关系凝胶浓度与孔径的关系一般来说,凝胶浓度越大

5、,孔径越一般来说,凝胶浓度越大,孔径越小,移动颗粒穿过网孔阻力越大。反之小,移动颗粒穿过网孔阻力越大。反之孔径越大。孔径越大。(3)凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围与凝胶浓度的关系 3影响凝胶聚合的因素影响凝胶聚合的因素(1)Acr及及Bis的纯度的纯度如试剂不纯,含有杂质或丙烯酸时,则凝胶如试剂不纯,含有杂质或丙烯酸时,则凝胶聚合不均一,或聚合时间延长甚至不聚合。聚合不均一,或聚合时间延长甚至不聚合。Acr和和Bis贮液的贮液的pH值为值为4.95.2,当当pH值的改变大于值的改变大于0.4则不则不能使用,因在偏酸或

6、偏碱的环境中,它们可不断水解,释放出能使用,因在偏酸或偏碱的环境中,它们可不断水解,释放出丙烯酸和丙烯酸和NH4+而引起而引起pH值改变,从而影响凝胶聚合。值改变,从而影响凝胶聚合。 因此,因此,配制的配制的Acr和和Bis贮液应置棕色瓶中,贮液应置棕色瓶中,4贮存,存放期贮存,存放期一般不超过一般不超过12个月为宜。个月为宜。(2)AP、TEMED一般一般AP溶液仅能存放一周溶液仅能存放一周。TEMED为淡黄色油状液,原液应为淡黄色油状液,原液应密闭贮存密闭贮存于于4冰箱中。增加冰箱中。增加AP和和TEMED可加快聚合速可加快聚合速率,但过量的率,但过量的AP和和TEMED会引起电泳时烧胶和

7、会引起电泳时烧胶和谱带变形。谱带变形。三、三、PAGE原理原理PAGE根据其有无浓缩效应,分为:根据其有无浓缩效应,分为:连续系统(无浓缩效应)连续系统(无浓缩效应)不连续系统(有浓缩效应)不连续系统(有浓缩效应)1.样品的浓缩效应样品的浓缩效应(1)凝胶层的不连续性)凝胶层的不连续性a. 样品胶:样品胶:大孔胶,样品预先加在其中,起防止对流的大孔胶,样品预先加在其中,起防止对流的作用,避免样品跑到上面的缓冲液中。(目前电泳一作用,避免样品跑到上面的缓冲液中。(目前电泳一般不制作)般不制作)b. 浓缩胶:浓缩胶:大孔胶,有防止对流作用,样品在其中浓缩,大孔胶,有防止对流作用,样品在其中浓缩,并

8、按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。积聚成薄层。c. 分离胶:分离胶:小孔胶,样品在其中进行电泳和分子筛分离。小孔胶,样品在其中进行电泳和分子筛分离。蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小,移动速度蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小,移动速度快,进入小孔胶时遇到阻力大,速度减慢。由于凝胶快,进入小孔胶时遇到阻力大,速度减慢。由于凝胶的不连续性,在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品的不连续性,在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩,区带变窄。浓缩,区带变窄。(2)缓冲离子成分的不连续性)缓冲离子成分的不连续性在电场中如有两种电荷符号

9、相同的离子向同一方向泳动,其在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向泳动,其迁移率不同,两种离子能形成界面,走在前面的离子称为迁移率不同,两种离子能形成界面,走在前面的离子称为快离子快离子(前导离子)(前导离子),走在后面的离子称为,走在后面的离子称为慢离子(尾随离子)慢离子(尾随离子)。为使。为使样品达到浓缩的目的,需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小样品达到浓缩的目的,需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中加入快离子,在电极缓冲液中加入慢离子。两相。即在三层

10、凝胶中加入快离子,在电极缓冲液中加入慢离子。被分离蛋白质分子的有效迁移率介于快慢离子之间,于是蛋白质被分离蛋白质分子的有效迁移率介于快慢离子之间,于是蛋白质在快慢离子间形成的界面处,被浓缩成极窄的区带。在快慢离子间形成的界面处,被浓缩成极窄的区带。 为了保持溶液的电中性及一定的为了保持溶液的电中性及一定的pH,需加入一种与快、,需加入一种与快、慢离子符号相反的离子,称为慢离子符号相反的离子,称为缓冲配对离子缓冲配对离子。使缓冲配。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三层凝胶及电极对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三层凝胶及电极缓冲液中)。缓冲液中)。(3)电位梯度的不连续性)电位梯度的不

11、连续性 在不连续系统中,电位梯度的差异是自动形成的。电在不连续系统中,电位梯度的差异是自动形成的。电泳开始后,由于前导离子的迁移率最大,就会很快超泳开始后,由于前导离子的迁移率最大,就会很快超过被分离物,因此在快离子后面,形成一个离子浓度过被分离物,因此在快离子后面,形成一个离子浓度低的区域,这时就有了较高的电位梯度。这种高电位低的区域,这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快梯度使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动。当前导离子、被分离物和尾随离子的移动速度移动。当前导离子、被分离物和尾随离子的移动速度相同时,建立一种稳定状态,这时在前导离子

12、和尾随相同时,建立一种稳定状态,这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面,离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面,由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,因此也就聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形间,因此也就聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。成一个狭小的中间层。 (4)pH的不连续性的不连续性 在浓缩胶与分离胶之间有在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性,这是为了的不连续性,这是为了控制慢离子控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率的解离度,从而控制其有效迁移率。要求在样品胶和浓缩胶中,。要

13、求在样品胶和浓缩胶中,慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样品夹在快、慢慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样品夹在快、慢离子界面之间,使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率离子界面之间,使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高,使样品不再受离子界面的影响,以比所有样品的有效迁移率高,使样品不再受离子界面的影响,以便蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离。便蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离。2分子筛效应分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程

14、度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。即使净电荷相同的蛋白质分子,也会由于分子筛效应在分离胶中被即使净电荷相同的蛋白质分子,也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。分开。与柱层析中的分子筛效应不同与柱层析中的分子筛效应不同3电荷效应电荷效应蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩,堆积成层,形成一狭蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩,堆积成层,形成一狭小的高浓度的蛋白质区,但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同小的高浓度的蛋白质区,但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同,因而迁移率不同。,因而迁移率不同。承载有效电荷多的,泳动的快,反之则慢。

15、承载有效电荷多的,泳动的快,反之则慢。因因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的区带。在进入分离此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的区带。在进入分离胶中时,此种电荷效应仍起作用。胶中时,此种电荷效应仍起作用。样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的,电荷效应与分子筛效应样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的,电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中进行的。主要是在分离胶中进行的。在蛋白质样品进入分离胶时,由于在在蛋白质样品进入分离胶时,由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面去,高电势梯度消失,使蛋白浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面去,高电势梯度消失,使蛋白质进入到均一电势梯度和质进入到均一电势梯度和pH的

16、分离胶中。此时,又由于分离胶的分离胶中。此时,又由于分离胶的孔径小,各蛋白质因分子大小和形状不一样而被孔径阻滞的程的孔径小,各蛋白质因分子大小和形状不一样而被孔径阻滞的程度也不相同,使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛度也不相同,使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。效应不同而得到分离。四、四、SDSPAGE电泳原理电泳原理l1967年,年,Shapiro等人首先发现,如果在聚丙烯酰胺凝等人首先发现,如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠(胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),),则则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量

17、蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小大小,当蛋白质的分子量在,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时,之间时,样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 SDS是阴离子去污剂,在水溶液中,以单体和是阴离子去污剂,在水溶液中,以单体和分子团的混合形式存在,由于分子团的混合形式存在,由于SDS带有大量负电带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷,因而消除或掩盖过了天然蛋白质原有的负电荷,因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异,使蛋白质了不同种类蛋

18、白质间原有电荷的差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷,因而可利用分子量差均带有相同密度的负电荷,因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。异将各种蛋白质分开。Marker分子量大分子量大 小小五、凝胶电泳的操作要点五、凝胶电泳的操作要点1凝胶的制备凝胶的制备制备凝胶时,要避免气泡存在。因此制备凝胶时,要避免气泡存在。因此各种贮存液混合各种贮存液混合后,应进行抽气处理后,应进行抽气处理。 一种为一种为阴离子电泳系统阴离子电泳系统(pH89),上槽接负极,下槽,上槽接负极,下槽接正极,可采用溴酚蓝作指示染料,一般蛋白质和核接正极,可采用溴酚蓝作指示染料,一般蛋白质和核酸在酸在pH89时带负电荷,在电泳时向正极移动。时带负电荷,在电泳时向正极移动。 另一种为另一种为阳离子电泳系统阳离子电泳系统(pH4左右左右),上槽接正极,下,上槽接正极,下槽接负极,可用亚甲基绿作指示染料,适用于碱性蛋槽接负极,可用亚甲基绿作指示染料,适用于

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