DNA复制与修复

1、勤不在三更五鼓 功只怕一曝十寒3 DNA的复制与修复DNA双螺旋结构模型的建立为DNA自我复制机制做了初步解释，即碱基互补两条链互补，碱基配对模板式复制。DNA复制中的问题1.细胞中的DNA是在双链螺旋的基础上进一步与蛋白质形成染色质的高级结构形式存在，而复制只在单链进行。2.在细胞周期中，DNA复制的起始和终止的调控。3.DNA分子很长，复制起始是随机的，还是固定的？4.不同DNA分子如环形、线形DNA复制如何终止。5.DNA复制的酶和蛋白因子。6.DNA复制的保真机制。7.DNA序列多态性的形成机制。8.DNA损伤及修复机制。3.1 DNA复制概述为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，

2、遗传信息载体必须精确地复制自己。遗传信息的载体是DNA，但许多病毒的遗传信息载体是RNA而不是DNA。3.1.1 DNA复制研究选材原核细胞是研究DNA复制的最佳的实验系统。细胞小，生活周期短，易在人工条件下培养，原核生物易获得各种突变体。原核生物中的大肠杆菌是在各方面研究最深入的一种。噬菌体（phage）是研究复制机制的一个重要实验系统。优点：基因组小，易操作；DNA分子有线形、环形、单链和双链形式，可代表不同类型DNA的复制。如：线型，式，D型等复制。已研究过的典型噬菌体系统：Phage x174, T43.1.2 DNA复制的半保留性Watson和Crick发表了DNA双螺旋模型之后又紧

3、接着发表了DNA半保留复制（semi conservative replication model）模型，这一建立在碱基互补基础上的机制，为DNA的转录、修复、和分子杂交等奠定了基础。DNA复制（replication）是在亲代双链DNA分子的每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同的DNA双链的过程。在半保留复制模型提出之前，普遍认为“蛋白质和核酸是彼此互补的，DNA自我复制过程是通过核酸和蛋白质的交替合成”。但Watson和Crick认为DNA自我复制时亲本链保持不变，但双链分成两半，每个亲本链作为复制的模板，子代双链含有一条亲本链和一条新合成的链。这就

4、是DNA复制的半保留模型。当时人们对半保留模型是持怀疑态度的，因双螺旋模型中存在最大的问题是双链是如何打开的？其所需的能量从何而来？Watson和Crick也承认这是“最大的问题”。人们为了避开打开双链这个难题，又提出了全保留复制(conservative replication model)和分散(dispersive model)两个模型。在全保留模型中两条母链彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链。在分散模型中亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”。后来通过实验证实其中半保留模型是正确的。DNA

5、复制的3种假说3.1.2.1 半保留复制在DNA的半保留复制过程中复制区域双螺旋解旋并分开，以每条单链为模板，按碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。由于每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semi conservation replication)。3.1.2.2 半保留复制的证据Meselson和Stahl的实验他们的同位素标记和密度梯度离心实验支持了半保留复制方式。1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA标

6、记，而不用放射性同位素32P和14C。15N会导致DNA分子密度显著增加，这样可通过密度梯度离心将亲本链和子代链区分开来。将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代，使DNA被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。分别取0代、1代、2代、3代的细胞，提取DNA，进行密度梯度离心，分辨重链DNA、正常的轻链DNA和包含一条重链和一条轻链的DNA“杂种链”。离心后从管底到管口DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处，紫外光下可以看到形成的区带。14N-DNA密度较轻，停留在离管口较近的位置；15N-DNA密度较大停留在较低的位置。当含有15N-DNA的细胞在14NH4

7、C1培养液中培养1代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间。培养2代后则在14N-DNA区又出现一条带。有等量的“杂种链”和轻链密度。这些结果只与半保留复制模型相符。全保留模型可以排除，但分散模型却不能排除。Meselson等又将第1代的14N/15N杂种链变性使双链分开，再将变性前后的双链和单链分别进行CsCl密度梯度离心。变性前杂种双链只有一种带，密度为1.717g/cm3，变性后两条单链的密度不同而呈现了两条带，一条为15N带，（1.740g/cm3），另一条为14N带（1.725g/cm3）。作为对照的是从肺炎球菌（D. pneumoniae）中提取的DNA，变性前后都

8、只有一条带，密度为1.700g/cm3。这一结果完全符合半保留复制预期的结果，并否定了全保留模型和分散模型。按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N和14N/15N两种DNA分子，随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。而14N-15NDNA区带逐渐减弱。Taylor的实验真核细胞的每条染色单体是由一条DNA双链组成，1958年Herbert Taylar用3H的胸腺密啶核苷酸处理蚕豆根尖细胞8小时，然后移入含有秋水仙素而没有标记放射性的培养液中。经标记处理后第一次分裂中期的染色体周围均显示放射性，每个染色体中有一条染色单体被标记，另一条染色单体未被标记。第二次分裂中期的染色体就只有一个显示有

9、放射性，而另一个却没有。证明真核DNA复制也符合半保留模型。姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatid differential staining）在复制过程中用胸腺嘧啶的类似物5-尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，BUdR）可掺入到新合成的DNA中。在两细胞周期之后，一条染色单体中含有DNA分子的双链都被BrdU取代，而另一条染色单体只有一条DNA单链中含有BrdU。若用荧光染料染色，DNA双股都含有Brdu的染色单体的荧光强度要小于DNA的单股含BrdU的染色单体的荧光强度，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体的荧光强弱不同。若用Giemsa染色，当双链都

10、插入5-BudR时则染不上Giemsa，而一条插入5-BudR则可染色。若细胞的培养基加入5-BudR则第二复制周期时，两条姊妹染色体染色状况不同，一明一暗，称花斑染色体。3.1.3 DNA复制过程的顺序性3.1.3.1 边解链边复制DNA的复制是边解链边合成从SV40复制的早期电镜照片可见复制部分和未复制部分。3.1.3.2 复制起点DNA复制是从DNA分子上特定位置（原点，origin）开始，此位置称复制起点(Origin of replication，ori)。复制起点（origin）是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌体、细菌染色体、质粒和一些动物病毒的DNA通常具有明显的复

11、制起点。酵母也有特异的复制起点，在细胞周期S期染色体复制时起重要的作用。真核生物的复制起点很复杂，现在还难于在分子水平上阐明其特征。大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，而真核生物染色体中有多个Ori。例如，果蝇染色体DNA约有3000个Ori位点，酿酒酵母第17号染色体中至少有400个Ori。3.1.3.3 复制方向DNA复制方向的可能性。研究DNA复制的方向常用温度敏感性变异菌株结合放射自显影技术。大肠杆菌的一个温度敏感株在42时能使DNA在完成复制后不再开始新的复制过程，而在25时复制功能恢复。将此温度敏感株在同一时间开始复制，细菌同步生长。先将这种同步生长的突变株在含高比度

12、3H-TdR中生长几分钟，再移入低比度3H-TdR中作脉冲标记。然后对菌体DNA作放射自显影分析。若复制是单向的，仅有一个高比度区，且高比度与低比度的放射性分布应该邻近。若复制是双向的，有两个分离的低比度放射性分布区。DNA可进行单向和双向复制，大多数DNA的复制是双向的。有些病毒（如腺病毒、29噬菌体等）及线粒体DNA的复制是单向进行的，滚筒式属单向复制。SV40为5224bp的环形分子，有1个EcoR切点。中用EcoR酶切复制中的SV40得到复制眼大小不同的系列DNA分子，可见随复制眼扩大两侧DNA变短，说明复制从原点开始双向复制。真核一般为多起点复制。也可利用变形对DNA电泳迁移的作用来

13、确定复制原点。例如用二维作图方法，即复制中DNA的限制性片段在第一维方向进行电泳，按分子量的大小分离。再在第二维方向电泳，第二维方向电泳移动主要由形状决定。不同复制中分子会有不同的路径，这可以通过它偏离双倍大小线形DNA分子的路线的程度来确定。复制起点的位置和复制叉的数目决定了限制性复制片段的形状，这些形状可通过不同的电泳路迹(实线)显示出来。虚线显示线形DNA的电泳路迹。DNA正在复制的分叉部位称为复制叉（replication fork）非复制DNA的旁边复制的DNA在电镜下象只眼睛称复制眼（泡）3.1.4 DNA的半不连续复制DNA复制是半保留复制，且是半不连续复制(Semi-disco

14、ntinuous replication)。DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是53方向，另一条是35方向。DNA复制时，新生链延伸方向一条为35，另一条为53。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化53延伸。3.1.4.1 半不连续复制的证据Okazaki（冈崎）于1968年通过H3脱氧胸苷（H3dT）标记实验证明了半不连续复制。实验材料T4感染的E.coli：野生型phageT4；mutant T4（连接酶突变）实验系统H3dT标记E.coli；phageT4感染；密度梯度离心。检测标记DNA在不同时间合成的情况。实验结果：短时间内，首先

15、合成较短的DNA片断（冈崎片段），接着出现较大的DNA分子。突变型连接酶T4中，大片段DNA很少或无。半不连续合成，放射性标记一半出现于短片段（冈崎片段），另一半出现在长片段DNA中。结论：DNA复制是半保留半不连续复制。3.1.4.2 半不连续复制在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是35，以此为模板的新生DNA链合成沿53方向连续进行，这条链称前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为53，以此为模板的新链合成方向也是53，但与复

16、制叉前进方向相反，且是分段的不连续合成，这条链称滞后链(lagging strand)，合成的片段为冈崎片段(Okaxaki fragments)。冈崎片段由DNA连接酶连成完整的DNA链。前导链的连续复制和滞后链的不连续复制，称为DNA合成的半不连续复制。3.1.5 复制子DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止。复制子(replicon)复制子或复制单元是基因组中具有一个复制起点（origin，ori）和一个复制终点（terminus，ter）并能在细胞中自主复制的单位。原核生物中，只有一个复制原点，每个DNA分子上只有一个复制子；真核生物中，每个DNA分子有多个复制子，每个复制子长约50

17、-200kb；其DNA复制是由多个复制子共同完成的。每个细胞中，染色体DNA复制子一般只复制一次。大肠杆菌DNA复制1次需42min；人类复制叉前进100bp/s，复制整个基因体需8hr；果蝇复制整个基因体仅需34分钟。染色体外遗传元件的复制子染色体外遗传元件包括：原核生物细胞中的质粒和噬菌体；真核生物细胞中的线粒体、叶绿体和病毒的DNA。染色体外遗传元件一般为单复制子（只有一个origin），但为多次复制，为多拷贝。真核生物的线粒体和叶绿体复制一般与核DNA同步或稍滞后；原核生物的染色体DNA和质粒（噬菌体）一般不同步，但整合后同步。质粒整合前为式或滚筒式复制，整合后为一个复制子。质粒为双向

18、复制。E.coli温敏型突变体在30复制正常，42时，E.coli复制起动受阻，而以质粒origin开始的单向复制。说明复制起始是受调控的。3.2 原核生物DNA的复制3.2.1 DNA的复制酶和相关蛋白DNA复制实际上就是DNA指导的DNA合成代谢，需要有DNA作为复制的模板。体外复制实验证明，新合成DNA的特异性完全取决于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。细胞内还有许多酶和蛋白质参与DNA的复制。3.2.1.1 解旋酶(Helicase)DNA复制时，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母链不断解开形成单链。大肠杆菌中的解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉的形成

19、，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸。3.2.1.2 单链DNA结合蛋白(SSB)解旋酶沿复制叉方向推进产生了一段单链区，细胞内大量的单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSB)能和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA。单链结合蛋白通过与磷酸骨架结合使DNA单链相互分开，它们离开暴露的碱基，所以那些碱基可以作为DNA合成的模板。SSB与解旋酶不同，它不具备酶的活性。在大肠杆菌细胞中主要SSB是177肽所组成的四聚体，可以和单链DNA上相邻的32个核苷酸结合。SSB的作用：使DNA单链保持一种伸展构象

20、，作为模板；使解开的单链不形成发卡结构；保护DNA单链不受Dnase水解。SSB结合DNA单链有协同性(cooperative binding)：一个SSB四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSB四聚体现相邻的单链DNA结合。SSB可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，并被重复利用。3.2.1.3 DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase)拓扑异构体（topoisomer)：具有不同螺旋数的同一DNA分子两种异构体。拓扑异构酶：可使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。DNA在细胞内以超螺旋状态存在，DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。

21、拓扑异构酶的功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNA nick，DNA的一条链进行解旋，旋转而改变DNA分子的拓扑状态。拓扑异构酶可使DNA发生连环化（catenate）、脱连环化（decatenate）、打结（knot）和解结（unknot）。拓扑异构酶参与DNA的复制、转录的重组等过程。拓扑异构酶的种类分为型和型。原核拓扑构酶：MW=100kD，单肽链，含34个Zn。作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。原核拓扑构酶作用机制：酶与DNA结合使双链解旋；使一条链切开，但酶与切

22、口的两端结合阻止了螺旋的旋转；酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋。拓扑异构酶拓扑异构酶也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNA gyrase)，能将负超螺旋引入DNA分子，在ATP供能时酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA。几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的方式存在，特别是进行半保留复制的DNA均以种种拓扑异构体的形式存在。负超螺旋是DNA复制的必需条件，负超螺旋可使DNA双链碱基对打开所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的

23、双链分开。真核生物拓扑异构酶酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。型：MW=95kD，单体蛋白，不需ATP。型拓扑异构酶型拓扑异构酶剪切一条链二条链机制酶非共价与DNA结合。一条链剪切，3-P基团共价与激活位点的酪氨酸残基结合。未剪切的链从缺口处通过。打断的链重新连接。酶非共价与DNA结合。两条链都剪切，5-P基团共价与激活位点的酪氨酸残基结合(这涉及对回旋酶和真核拓扑异构酶有4bp交错)。未被切割的双链通过构象改变从缺口通过。打断的双链重新连接。需要ATP不是大肠杆菌topo I(蛋白)、topo释放负超螺旋回旋酶(topo) ：诱导负超螺旋t

24、opo IV：去连接连锁的环真核拓扑异构酶：释放正和负超螺旋拓扑异构酶：释放负超螺旋(弱活性)，不去连接拓扑异构酶：释放正和负超螺旋拓扑异构酶：释放负超螺旋，可能也能释放正超螺旋型：MW=150180kD，均为二聚体，需ATP和Mg2+。3.2.1.4 引物酶(Primase)引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA（610nt）作为DNA合成的引物。引物的意义在于减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA随后被降解，从而减少了复制错误。DNA合成以RNA为引物的实验证据Reiji 以32PdNTP标记未标记NTP为底物。引发合成后，用稀碱处理。32P出现

25、在水解产物中（RNA水解），证明RNA为引物。引物酶催化引物RNA分子的合成，但它不同于RNA聚合酶。引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感；引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。大肠杆菌的引物酶由一条多肽链组成，MW为60KD，每个细胞中有50100个分子，由大肠杆菌的dnaG基因编码。但在单链噬菌体M13 DNA和质粒Co1E1 DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌体T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。3.2.1

26、.5 DNA聚合酶(DNA Polymerase)DNA聚合酶的性质以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA；需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA链；催化dNTP加到生长中DNA链的3-OH末端；催化DNA合成的方向是53。原核DNA聚合酶有三种：DNA polymerase 、DNA polymerase 和DNA polymerase 生化教研室幻灯片96DNA pol的发现1956年，Kornberg用无细胞E.coli系统证明DNA是模板合成。1957年发现DNApol。大肠杆菌DNA polymerase 1956年Kornberg发现DNA聚合酶，又称Kornbe

27、rg酶。此酶已经研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。酶的性质DNA pol由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个SH基。每个分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子37下能催化667nt/min掺入正在生长的DNA链。DNA pol可被枯草杆菌蛋白酶裂解成2个片段，大片段MW为76KD，称为Klenow片段，具聚合酶和35外切酶的活性，由两个结构域组成。小片段的MW为34KD，具有53外切酶活性。DNA Pol在空间结构上近似球体，直径约65Å，在酶的纵轴上有一个约

28、20Å的深沟(cleft)，带有正电荷，是酶的活性中心位置。酶的活性中心位置上至少有6个结合位点：a. 模板DNA结合位点；b. DNA生长链或引物结合位点；c. 引物末端结合位点；d. 脱氧核苷三磷酸结合位点；e. 53外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5-端脱氧核苷酸并切除之；f. 35外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3-端核苷酸。酶的功能a. 聚合作用在引物的3-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol逐个聚合上核苷酸。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化

29、，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。b. 35外切酶活性（校对作用）35外切酶活性是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。错误核苷酸进入pol的结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象而被35外切酶活性位点所识别并切除。在T4噬菌体突变株中分离得到的T4 DNA聚合酶的35外切酶活性很低，使DNA复制的真实性降低，而易发生突变。具有抗突变能力的T4突变株中的DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。35外切酶活性的主要功能是校对作用。维持了DNA复制真实性。c. 53外切酶活性（切除修复作用）：53外切酶活性是从53方向水解DN

30、A生长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺旋DNA，并在切口以外的配对区切割。53外切酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5-末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性（每次能切除10nt）。DNApol聚合酶活性和53外切酶活性协同作用双链DNA上的单链切口可激活DNA pol的53外切酶活力，从切口的5-端切除旧链，同时从切口开始合成新链，可使DNA链上切口向前推进，产生缺口平移(nick translation)，即没有新DNA合成，只有核苷酸交换。缺口平移可从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为-32P-dNTP，则重新合成的新

31、链为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。DNA pol不是大肠杆菌中DNA复制的主要酶。a. 体内DNA合成速率比纯化的DNA pol催化dNTP掺入速率（667nt/min）高20倍；b. 大肠杆菌的一个突变株中，pol的活力正常，但染色体DNA复制不正常；c. 在一些突变株中，pol的活力只是野生型的1%，但DNA复制却正常，而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。DNA pol在DNA修复中起着重要的作用。大肠杆菌DNA pol 1970年发现DNA pol。MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNA pol的5%。聚合作用:pol催化DNA的

32、聚合，它最适模板是双链DNA而中间有小空隙(gap，50200nt)的单链DNA部份。pol具有35外切酶活性，但无53外切酶活性。pol缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制正常。表明pol不是DNA复制的主要酶，它可能在DNA损伤修复中起一定作用。大肠杆菌DNA polDNApol 的发现DNApol的合成DNA，参入nt的速率为600nt/min，但实际测定数约12000nt/min，比DNA pol 的催化速率大20倍。遗传分析表明，DNA复制涉及多种基因，但DNA pol是单肽链。1969年，Cairns发现E.coli的一种突变体的细胞抽提液，虽然反应显示1%的DNA pol活力，但该突

33、变体能以正常速率繁殖。突变体对紫外辐射和化学诱变十分敏感，表明可能存在另一种DNA pol。DNA pol 是至少以10种亚基组成的复合物参与DNA的复制，此复合物称为DNA聚合酶全酶。a、e及q亚基构成核心聚合酶(core polymerase)。a具有聚合酶；e有35核酸外切酶的活力。b构成聚合酶的卡箍(clamp)，结合在DNA模板链上。DNA聚合酶的主要亚基及其装配层次组成亚基 MW(×103) 组装层次 a 130 27.5 10 71 47.5 35 33 15 12 40.6pol pol pol *全酶复合体生化教研室幻灯片118生化教研室幻灯片119层次 持续性 刺

34、激因子pol 10 无pol 60 亚精胺pol * 200 SSB全酶 105 SSBpol 全酶的结构是一种非对称二聚体。pol 在细胞内数量少（每个大肠杆菌细胞中只有1020个酶分子），但催化dNTP掺入DNA链的速率是DNA pol的15倍。pol具有聚合酶和35外切酶活性。DNA pol 是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度(non permissive temperature)内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合成DNA，但加入pol 则可以恢复其合成DNA的能力。3.2.1.6 DNA连接酶(DNA ligase)DNA在随后链上的复制是不连续的，合

35、成的DNA片段需要连接酶连接。DNA连接酶的主要功能是借助ATP或NAD水解提供的能量，催化双链DNA上的单链间隙的5-端与3-端生成磷酸二酯键，封闭DNA双链上的缺口。DNA连接酶的作用条件被连接的两链必须与另一链（模板链）互补； 两链相邻；每次只能连接一个切口；使一条链的5-P与另一链的3-OH形成磷酸二酯键。连接能量来自NAD（如E.coli或T4诱导的连接酶，动、植物中的酶）。缺口缺失核苷酸不连接。连接酶作用机制NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的1个Lys残基的-NH2上。酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基转移到DNA的5-磷酸基端。被激活的5-磷酰基端和DNA的3-OH端生成

36、磷酸二酯键。DNA连接酶催化的连接反应是可逆的。逆反应过程可在AMP存在时，使共价闭环超螺旋DNA产生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。大肠杆菌的DNA连接酶(MW 75KD)被胰蛋白酶水解形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD（不是ATP）反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。大肠杆菌细胞中约有300个分子的DNA连接酶。与DNA聚合酶的分子数相近。连接酶在DNA复制、修复和重组中起重要作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。在真核生物细胞中的DNA连接酶，分为连接酶和，反应中利用ATP所提供的能量。DNA连接酶

37、分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中，DNA连接分子量约85KD，主要存在于生长于不活跃的细胞中(resting cell)。在DNA复制过程中还有许多蛋白质参与，如大肠杆菌细胞中就有三十多种蛋白质参与DNA复制，许多蛋白质的功能目前尚不明了。DNA复制过程中还有许多未知的因子参与，DNA复制过程中许多具体的细节尚不十分清楚。T4Ligase(连接酶)特性可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA。可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平齐末端切口。T4Ligase可作为重组工具酶。3.2.2 原核生物DNA复制的引发尽管原核生物是较简单的单细胞生物体，但其复制过程很复杂

38、，并且是一个顺序性过程，涉及到多种酶和蛋白因子，是这些酶和蛋白因子协同作用的结果。对E.coli DNA复制机制的认识是利用E.coli突变体和x174的复制进行初步研究的结果。研究方法：获得突变体，对突变基因研究获得其功能；反义RNA基因工程；点突变基因工程。大肠杆菌复制基因利用噬菌体研究原核DNA复制噬菌体DNA有线型、环型、单链、双链，其复制机制可表明各种形式的DNA复制模式；噬菌体利用寄主的基因产物进行复制，复制行为与寄主相似。3.2.2.1 M13噬菌体复制的引发M13基因组为6407nt的单链环状DNA分子，在54805820nt间有5个发夹结构，其中第3个最重要，有59个nt，此

39、双链区是一个复制起始的信号。M13利用宿主细胞的RNA聚合酶起始RNA的合成，在发夹结构前6nt，开始合成引物RNA。对于RNA聚合酶如何识别这个发夹结构作为起始位点的还不清楚，可能还涉及其他一些蛋白质。合成2030nt的RNA链后就破坏了发夹结构，由于形成RNADNA杂交体，就把另一半发夹结构释放出来。因此，SSB就结合到这段序列上。DNA pol III以RNA为引物合成DNA链直到RNA引物的开始处。引物被DNA pol I切除并补齐因RNA切除后形成的空缺，切口再由连接酶连接起来。G4噬菌体(5577nt)的复制与M13的不同之处在于它不是由RNA聚合酶起始复制，而是由引物酶直接结合到

40、不能结合SSB蛋白的发夹结构上，引物酶合成一段2629nt，互补于发夹结构一条链的RNA。DNA链在RNA 3-OH上延长，此后的反应和M13是相同的。因此，M13的复制能被RNA聚合酶的抑制剂利福平所抑制，而G4和X174的复制则不被利福平所抑制。泳道1：引物合成时不加dNTP；2：引物合成后加入dNTP；3：起始反应时加入dNTP和NTP3.2.2.2 x174的复制X174的复制比M13和G4复杂，需要更多的蛋白质因子参与，形成一个类似大肠杆菌中的复制引发体，并且可能在几个位点起始DNA的合成，可作为冈崎片段合成起始的范例。x174的复制模式x174的DNA复制除模板外，复制系统均由寄主

41、提供。x174（+）链（SS）®合成x174（-）链，形成RF x174（SSRF）®RF繁殖（RFRF）®新的x174（+）链产生（RFSS）fX174的()链合成(SSRF)fxl74的(+)链进入寄主细胞，除分子中的发夹结构外，其它部分被SSB覆盖。()链合成(SSRF)需引物体(primosome)参与。在基因F和G间的70nt片段是引物体组装位点(primosome assembly site，pas)，pas形成44nt组成的发夹结构可被PriA识别，在PriB和PriC参与下形成复合物。由PriA、PriB和PriC组成的复合物与DnaT、DnaB和

42、DnaC组装成预引物体(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP稳定化的B6C6复合物。预引物体与引物酶（DnaG）结合成引物体。引发体在pas位点上形成，但引物合成是在很多位点上，表明引发体可沿着单链DNA引发位点移动。当引物合成后，PriA水解ATP引起DnaB变构而降低与单链DNA的亲和性，移动到另一个起始位点，ADP又被ATP取代，引物酶能稳定DnaB·ATP·ssDNA复合物，开始另一个引发反应。引发体至少含DnaB、PriA和引物酶。PriA可识别pas位点，并且还具有水解ATP和置换SSB的活性，这对引发体移动到其它位点进行引发非常重要。

43、M13和G4仅有一个引发点。DNAPol全酶从引物延伸合成DNA片段。引发体移动的方向同DNA链延长方向相反，这说明双链DNA复制时，随从链合成冈崎片段的情形。当复制叉向前移动时，在引发体前方就形成单链，每一次引发反应以后，引发体就沿着单链向前移动到下一个冈奇片段合成开始的位点。因此，引发物移动的方向同复制叉相同，同随从链DNA合成方向相反。Pol切除RNA引物填补缺口，连接DNA片段。形成的双链DNA称为RF。引物体继续与DNA相结合以备参与(+)链的合成。fxl74()链合成是不连续的。fX174的(+)链合成(RFSS)(+)链合成涉及噬菌体编码的gpA和大肠杆菌的Rep。gpA（60k

44、D）对(+)链原点具有专一性的核酸内切酶活力。gpA的功能是引发复制起始。gpA借引物体结合于识别位点，专一性切割4305和4306间的磷酸二酯键产生切口。gpA通过其酪氨酸残基与4306位5端结合，保存链能。Rep蛋白结合于gpA处的()链。Rep蛋白从(+)链使gpA复合物从(+)链的5端开始使双链DNA解链，分离出的(+)链被SSB保护。pol全酶从(+)链3端使DNA链不断延伸，形成环化的滚环结构(looped rolling structure)。而原来的(+)链在复制叉移动时仍与gpA相连，如同逐步被剥离。复制绕()链超过完整一周后产生1个双股复制原点，gpA在此再做专一切割，再与

45、新形成的5端共价结合，gpA的第2次切割产生单位长度的fX174 DNA，它的3-OH向gpA5-P做亲核攻击形成环状分子（+链）。每个gpA分子含2个活性酪氨酸，故可完成相继地切割，并与5-端相连。在由fx174感染的中期，每个新合成的(+)链指导()链合成从而形成RF。在感染的后期，新合成的(+)链通过噬菌体编码的病毒成熟蛋白和衣壳蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。x174（-）链合成为随后链复制模式。可用于研究E.coli随后链的合成机制，不连续合成。x174（+）链合成为主导链复制模式。可用于研究E.coli主导链的合成机制。连续合成。大肠杆菌基因组是双股环形DNA，

46、其复制是由单一原点（origin）开始的q式复制。origin处形成复制叉，经过先导链的连续复制和滞后链的不连续复制，到达终点完成复制。3.2.2.3 E.coli DNA复制的引发E.coli的DNA复制起始指从origin（原点）开始的 起始过程，这一过程不同于随后链上冈崎片段的起始。DNA复制的引发包括：起始识别解链解旋引发体组装。（由于解链导致正螺旋加大最终导致难以解开所以要解旋）复制原点（origin)DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始。大肠杆菌的复制起始点(oriC)位于其基因组天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子间，oriC包含245bp。ori

47、的特性复制起点几乎都是富含A-T的序列；已经分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。由245bp的DNA片段组成。oriC含有2个系列的重复单位，其中有3个13bp重复序列和4个9bp重复序列，均富含AT。ori在所有细菌复制起始位点中都是保守的oriC在不同原核生物中有同源性，很多细菌的ori区在结构上相似，在序列上有相当的保守性，且在分类关系上愈接近的细菌间其同源性愈高，表明DNA复制起点的重要性。将一个复制起点连接到任一DNA上，都能支持其复制。9bp（A位点）为DnaA蛋白识别位点。引发体的形成复制开始的是形成引发体，这需要很多蛋白因子的参与。DnaA蛋白识别起始序列并结合于ori

48、C（复制起始点）的9bp重复序列，形成oriC负超螺旋包裹在外，2040个DnaA蛋白在内的复合物。HU蛋白参与并促进DnaA蛋白识别3个13bp串联重复序列使DNA熔链形成开放复合物。用核酸酶P1（作用ssDNA单链DNA）证明解链部分约为45bp。DnaB和DnaC（引发体成员）蛋白进入熔链区形成前引物复合体。SSB结合在被解开的单链上，由PriA、PriB、PriC、DnaT、DnaB和DnaC等6种蛋白质组成引发前体(preprimosome)。引发前体进一步与引物酶(DnaG，primase)组装成引发体(primosome)。在SSB和旋转酶（拓扑异构酶）的参与下，引发体可在单链D

49、NA上移动，在DnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。引发体先在前导链上由引物酶催化合成RNA引物，此过程称为转录激活(transcriptional activation)。DNA pol组装和复制叉上二聚体形成。引发体在滞后链上沿53方向相对移动，并在模板链上断断续续地引发生成滞后链的引物RNA，供DNA聚合酶合成冈崎片段使用。在RNA引物3端DNA开始聚合。许多因子协同作用才使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。R

50、NA引物形成后，DNA pol 的亚基组装成非对称DNA聚合酶二聚体，它催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。3.2.3 DNA链的延伸3.2.3.1 正超螺旋的消除螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链，DNA聚合酶催化DNA新生链的合成。DNA解链时必产生正超螺旋，当达到一定程度后就会造成复制叉难以继续前进而终止DNA复制。而细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。解除正超螺旋的机制DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和。DNA拓扑异构酶可打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状

51、态；同时DNA拓扑异构酶(旋转酶)也可以在复制叉前方地将负超螺旋引入双链DNA。3.2.3.2 复制体(replisome)的形成DNA复制体是在复制叉附近，由DNA pol二聚体、引发体和DnaB等构成的类似核糖体大小的复合体。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。不同系统（噬菌体、E.coli、动物、植物病毒）中的复制体组分虽有差异，但功能相似。复制体包括Ori的复制体（主导链和随从链的是否相同）和复制起始后延伸过程的复制体两种。延伸过程的复制体为非对称的DNApol 二聚体、DnaB、随从链上的SSB和引发体等组成。3.2.3

52、.3 DNA链的延伸前导链和滞后链由同一pol 二聚体延伸。前导链的合成：由DnaG（primase）在复制起始位点附近合成1个1060nt的RNA引物，然后由pol 把dNTP加到该引物上。滞后链的合成：产生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I补上一小段DNA序列，由DNA ligase把两个片段相连。DNA滞后链与主导链合成的不同步。在DNA复制叉处由一个非对称DNA pol二聚体，同时分别进行复制DNA前导链和滞后链。位于滞后连的引发体，在合成引物后DnaG可将模板链提起（或成环），使RNA引物3端位于pol 处，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方

53、向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。pol 的每一个催化中心合成一个子链。DnaB负责在复制叉上向前移动。引发体拖着一条DNA链通过。DNA pol沿着滞后链模板催化在RNA引物上聚合DNA链。滞后模板链被SSB结合，随冈崎片段延伸priA可利用ATP供能除去SSB。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及新合成的冈崎片段便从DNA聚合酶上释放出来。卡箍的分离和缔合复制叉不断迁移便又产生了一段滞后链模板，它重新环绕pol，并合成冈崎片段。因此，前导链合成不会超过滞后链太多。这样引发体在DNA链上和pol同速移动。当冈崎片段形成后，DNA pol通过其5

54、3外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物；同时，利用后一个冈崎片段作为引物合成DNA。最后的缺口由DNA ligase连接形成完整的滞后链。DNA复制过程在复制叉形成复制体（DnaB、亚基与DNA结合，引发体形成，2×pol 复合体形成）3.2.4 DNA复制的终止3.2.4.1 E.coli DNA复制的终点在DNA上存在着复制终止位点，复制叉在此位点相遇（forks meet）。E.coli的DNA复制终点序列（23bp）：AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA终止序列可被tus蛋白（tus基因编码）识别，并结合于其上，它只让一

55、侧复制叉通过，并可能阻止DnaB的解链作用，使DNA复制在终止位点终止。E.coli的两个复制叉在相距终点100kb时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。终止的调节：在终止点Forks meet两侧各有几个短序列，如：terE、D、A；terC、B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个“replication fork trap”3.2.4.2 DNA复制后的末端问题DNA复制时，当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合所填充。而线性DNA分子以53为模板的滞后链的合成，末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。T7-DNA复制方式