蛋白质氨基酸测定

1、LOGO蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定LOGOv1 概述v2 凯氏定氮法v3 蛋白质的快速测定法v4 氨基酸总量的测定v5 氨基酸的分离与测定主主 要要 内内 容容LOGO1 概述概述（1）蛋白质的生理功用及在食品中的作用）蛋白质的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数）蛋白质系数（4）蛋白质水解）蛋白质水解（5）蛋白质测定方法）蛋白质测定方法LOGO 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。 人体的酸碱平衡、水平衡的维持； 遗传信息的传递； 物质的代谢

2、及运转都与蛋白质有关。 人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质 食品的重要营养指标。LOGO(2) 食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量 在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品， 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。LOGO（3）蛋白质系数）蛋白质系数 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万数百万，。由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学

3、元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。LOGO 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。 LOGO（4）蛋白质水解）蛋白质水解 在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨

4、酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。 蛋白质蛋白质胨胨肽肽氨基酸氨基酸LOGO（5）蛋白质测定方法）蛋白质测定方法 测定蛋白质的方法可分为两大类： 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键和折射率测定蛋白质含量 ； 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。 LOGO 蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品的蛋白质系数有所不同。 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，

5、可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。2 LOGO 凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。 目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。 在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。 常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。LOGO(1) 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨

6、蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。LOGO有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。LOGO 蒸馏蒸馏在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： ：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收

7、及滴定的反应方程式如下：aLOGO(2) (2) 适用范围适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定(3)(3)仪仪器器500ml凯氏烧瓶；定氮蒸馏装置(4)(4)试剂试剂硫酸铜 ； 硫酸钾； 硫酸； 40gL硼酸溶液； 混合指示剂； 400gL氢氧化钠；0.1molL盐酸 标准溶液LOGO2.3 样品的分解条件样品的分解条件（1）K2SO4或Na2SO4 ：提高溶液的沸点（2）催化剂 CuSO4 氧化汞和汞 良好的催化剂，但剧毒； 硒粉（3）氧化剂 过氧化氢LOGO硫酸钾 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏

8、度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解 ，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高，其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。LOGO硫酸铜 CuSO4 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO

9、4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 可以指示消化终点的到达 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。LOGO(5) 操作步骤操作步骤样品消化：样品消化：准确称取均匀的固体样品0.53g,或半固体样品25g,或吸取溶液样品1525ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.51g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿

10、色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。LOGOLOGOLOGO 蒸馏蒸馏、吸收吸收LOGO冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml 40gL硼酸溶液及混合指示剂56滴）。LOGO 滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。LOGO式中W蛋白质的质量分数，%； c盐酸标准液的浓度，mol/L； V1空白滴定消耗标准液量，mL； V2试剂滴定消耗标准液量，mL； m样品质量，g； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数。100014. 0)(12mFVVcW(6) 结果计算LOGO2.2

11、 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器仪器微量凯氏定氮器。微量凯氏定氮器。LOGOLOGO100ml凯氏烧瓶。凯氏烧瓶。微量凯氏定氮器。微量凯氏定氮器。 LOGO 20g/L硼酸溶液。 400g/L氢氧化钠。 1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。 0.01000mol/L盐酸标准溶液 其他试剂同常量法。LOGO ：样品消化步骤同常量法。将消化完全

12、的消化液冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 LOGO 蒸馏 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。LOGO由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入10ml使呈强碱性，用少量蒸馏 水洗漏斗数次，盖塞 ，进行水蒸气 蒸馏。冷凝管下端 预先插入盛有10mL4%（或2%）蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1mi

13、n，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 LOGO 滴定 取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。LOGO(5) 结果计算结果计算 式中W蛋白质的质量分数，%； V0滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol； F蛋白质系数； m样品质量，g。%100100014. 0)(201VmFcVVWLOGO（1）所用试剂应用配制。（2）消化过程应注意凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。（3）若

14、样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。（4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L23ml后再加热。2.4 注意事项注意事项LOGO（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁

15、量多时，呈较深绿色。LOGO（7）蒸馏过程应注意接头处无现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（8）不应超过40C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂在碱性溶液中呈，在中性溶液中呈，在酸性溶液中呈。LOGO 半微量凯氏定氮半微量凯氏定氮LOGO测定蛋白质的其它方法测定蛋白质的其它方法v双缩脲法双缩脲法 双缩脲 蛋白质的肽键与双缩脲结构类似，可形成紫红色络合物，比色测定（560nm）CuSO4NaOH紫红色络合物紫红色络合物LOGOv紫外吸收法紫外

16、吸收法 利用氨基酸残基中某些基团的紫外吸收特性 1、A280 芳香环残基产生特征吸收， 38mg/ml内， A280 正比于蛋白质浓度 生化分析，快速LOGOv2、A280/A260v 校正核酸的干扰作用校正核酸的干扰作用LOGOv3、A215-A225（适用于蛋白质稀溶液）（适用于蛋白质稀溶液） A215-A225与蛋白质浓度呈线性关系，与蛋白质浓度呈线性关系，（20100mg/l）v4、肽键紫外吸收法、肽键紫外吸收法 A238与蛋白质浓度呈线性关系与蛋白质浓度呈线性关系 （50500mg/l）LOGO福林福林-酚法酚法 （1）在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白）在碱性条件下，蛋白质与铜作

17、用生成蛋白质质铜络合物。（铜络合物。（双缩脲反应）双缩脲反应） （2）此络合物（）此络合物（酪氨酸酪氨酸/色氨酸）色氨酸）将试剂磷钼将试剂磷钼酸酸磷钨酸（磷钨酸（FolIn试剂）还原，混合物深蓝色试剂）还原，混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。含量成正比。 A750 灵敏度高（灵敏度高（ 050mg/l） 干扰较大（酚、柠檬酸）干扰较大（酚、柠檬酸）LOGO考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法v考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250蛋白质结合蛋白质结合vA620 灵敏度高，干扰小 0100mg/lLOGO染料结合法染料结合法v蛋白质蛋白质氨基

18、黑氨基黑/酸性橙酸性橙12（定量结合）（定量结合） 测定剩余染料量测定剩余染料量v样品的溶解性不好时也可适用样品的溶解性不好时也可适用LOGO水杨酸比色法水杨酸比色法v消化消化铵盐铵盐水杨酸钠水杨酸钠/次氯酸钠（蓝色）次氯酸钠（蓝色）vA660LOGO红外光谱法红外光谱法v蛋白质在某些红外波段具有特征吸收蛋白质在某些红外波段具有特征吸收 吸收强度正比于成分浓度LOGOv蛋白质序列测定蛋白质序列测定 末端测定vN-末端末端丹磺酰化法丹磺酰化法 末端NH2-DNS水解DNS-氨基酸提取分析vC-末端末端羧肽酶法（从羧肽酶法（从C段顺序降解氨基段顺序降解氨基酸）酸）LOGO4 4 氨基酸态氮的测定氨

19、基酸态氮的测定LOGO(1) 甲醛滴定法原理甲醛滴定法原理氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的基和碱性的-NH2基。它们相互作基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。反应式如下：方法测定氨基酸的总量。反应式如下：RCHH3N CCOR CCOHOHNH2+HCHORCCOOHHN CH2+NaOHRCHCOOHNH CH2OH或R CH COOHN(CH2OH)2或RCH COONaNCH2或 R CHNHCOOHCHOLOGO4.2 电位滴定法电位滴定法(1)原理原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴值判断和控制滴定