NO对实验性局灶脑缺血再灌流神经细胞凋亡影响的定量研究

1、    NO对实验性局灶脑缺血再灌流神经细胞 凋亡影响的定量研究        摘要：目的研究NO在局灶性脑缺血再灌流过程中对神经细胞的作用机制，特别是NO与细胞凋亡的关系。方法利用流式细胞仪检测法，测定N-硝基-左旋-精氨酸(NNLA)干预后局灶性脑缺血鼠脑组织中神经细胞的凋亡情况。结果在缺血再灌流期间过多或过少的NO均对缺血区凋亡峰有明显影响，小剂量NNLA减少神经细胞凋亡的发生率，大剂量NNLA增加神经细胞凋亡的发生率。结论局灶性脑缺血的不同区域，包括正常及病

2、变组织中的凋亡细胞在数量及生物学意义上有很大的差别。不同剂量的NO对神经细胞凋亡的影响不同。关键词：一氧化氮;细胞凋亡;流式细胞仪;大鼠分类号：R743文献标识码：A文章编号：1003-2754(2000)01-0002-03Quantitative study of NO effect on the neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia and reperfusionLU Xiao-hongWU JunMA Yu-gang(Department of Neurology,The First Clinical Hospital of

3、Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)Abstract：ObjectiveTo study mechanism of nitric oxide effecting on neuronal apoptosis (NO) in the focal cerebral ischemia and reperfusion,and relationship between NO and apoptosis. MethodsFlow cytometry (FCM) was used to observe cha

4、nges of neuronal apoptosis in the focal cerebral ischemia and reperfusion,experimental rats were treated with N-nitro-L-arginine(NNLA) via intraperitineal injection. ResultsThe increase or decrease of NO content effected the percentage of DNA fragmentation in the ischemic region distinctly. Small NN

5、LA dose can be decreased incidence rate of neuronal apoptosis,high dose NNLA increased. ConclusionThere is cell apoptosis in normal cerebral and ischemic penumbra and core of the infarction. The number and biology significance of apoptosis cell in these parts is distinction obviously. It is differen

6、t that different dose of NO influenced on incidence rate of neuronal apoptosis.Key words：Nitric oxide;Neuronal apoptosis;Flow cytometry;Rat细胞凋亡是生命过程中不可缺少的组成内容，是多细胞生物藉以存活的需要，因而贯穿于生物全部生命活动中。从细胞自身调控的角度研究缺血性脑损伤的机制，不仅对其机制有了新的认识，也为如何减轻缺血性脑损伤提供了新思路。目前凋亡细胞的判断方法主要为14：(1)形态学；(2)DNA凝胶电泳；(3)TUNEL；(4)流式细胞术。我们选用流

7、式细胞仪(FCM)检测局灶性脑缺血再灌流过程中NO对神经细胞凋亡的影响。1材料与方法1.1制作大鼠大脑局灶缺血再灌流模型Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重200250g，鼠龄34个月,健康合格,全部由本校实验动物部提供。采用Koizumi5所采用的不开颅、无需麻醉即可再灌流的栓线法制作大脑局灶缺血再灌流模型。1.2实验动物分组将40只大鼠分成5组。(1)正常对照组：5只,常规饲养。(2)假手术对照组：5只,常规制作局灶缺血模型，在手术操作过程中，不将栓线导入大鼠脑动脉系统中，余同手术组,饲养1d后处死。(3)手术对照组(实验1组)：10只,缺血3h再灌1d处死。(4)NOS抑制剂干预1组(

8、实验2组)：10只,缺血3h，术后30min给予NOS抑制剂 NNLA 5mg/kg腹腔注射，再灌20h时再次给予同样剂量的NNLA腹腔注射1次，于再灌24h时处死。(5)NOS抑制剂干预2组(实验3组)：10只,缺血3h，术后30min给予NOS抑制剂 NNLA 30mg/kg腹腔注射，再灌20h时再次给予同样剂量的NNLA腹腔注射1次，于再灌24h时处死。1.3FCM检测大鼠直接断头取脑，将左右半球分别分为丘脑区、海马区及皮层区，再将左侧半球皮层区按Linnik6方法分成相同的3个区。分别制成单细胞悬液，4冰箱保存备用。冻存样本用PBS洗3次，350目尼龙网过滤,加入RNase水浴后，加入

9、PI染色，上机检测。2结果测定了实验1组、实验2组、实验3组左右半球8个部分的细胞周期及亚二倍体峰(凋亡峰Ap峰)的百分率，结果见表1。表1局灶性脑缺血再灌流模型各组鼠脑细胞不同部位流式细胞仪检测凋亡细胞结果(%)只数左半球(手术侧)右半球(非手术侧)皮层区海马区丘脑区皮层区海马区丘脑区非梗死区半影区坏死区实验1组59.32±6.6627.82±20.3751.08±15.4957.72±14.2551.48±10.428.84±8.9612.62±25.4725.34±19.87实验2组517.64±1

10、8.1438.40±14.1814.08±23.8540.78±5.2257.82±8.8016.40±11.9723.52±15.0420.72±26.10实验3组516.20±9.5062.42±11.5144.32±21.7666.30±7.1856.12±9.348.64±7.8911.66±23.7016.24±5.04同组间各部位与非梗塞区相比P<0.05,P<0.01;同组间半影区与坏死部位相比P<0.01;同组间

11、各坏死部位(包括左侧半球的梗死区、海马及丘脑区)相比P<0.01;左右侧海马区或丘脑区相比P<0.01;实验组与手术对照组相比P<0.01;实验组之间相比P<0.01各组不同部位的亚二倍体峰的百分率经统计学交互作用的多重比较(Newman-Keuls法)处理，结果显示：(1)同组间手术侧半影区、梗死区、海马区及丘脑区与同侧非梗死区相比均有显著差异，即病变部位出现凋亡峰的百分率明显高于非梗死区；(2)同组间半影区与梗死区相比，实验1组及实验2组差异显著，梗死区的凋亡峰明显高于半影区；实验3组无明显差异；(3)同组间各坏死部位(包括左侧半球的梗死区、海马区及丘脑区)相比，仅

12、实验2组差异显著，海马区及丘脑区的凋亡峰明显高于梗死区,其余两组无差异；(4)两侧半球的海马区及丘脑区分别相比，均有明显差异，手术侧的凋亡峰明显高于非手术侧；(5)实验2、3组分别与实验1组相比，实验2组的海马区及实验3组的丘脑区有显著差异，实验2组海马区的凋亡峰明显低于实验1组；实验3组丘脑区的凋亡峰明显高于对照组；(6)实验组之间相比，缺血部位(指手术侧除非梗死区以外的所有部位)除丘脑区外，两组之间均有显著差异，实验3组的凋亡峰均高于实验2组；(7)非手术侧不同部位、不同组之间相比，均无差异；(8)各组手术侧的非梗死区相比，也无差异。综上所述，3组不同部位亚二倍体峰百分率的比较具有以下特点

13、：(1)正常脑组织中的神经细胞即可测得凋亡峰；(2)脑组织缺血区的凋亡峰明显高于非缺血区，而且半影区与坏死区之间差异显著；(3)在缺血再灌流期间过多或过少的NO均对缺血区凋亡峰有明显影响。 3讨论NO参与了缺血性脑损伤的过程，并可能与神经细胞凋亡的发生有关，将3者结合起来研究，如果NO能够阻断PCD的某些环节，将可能开辟更新更有效的脑缺血防治措施。3.1流式细胞仪检测在局灶性脑缺血再灌流模型中检测凋亡细胞的意义由于凋亡细胞及其释放的凋亡小体的DNA含量只是正常Go/G1细胞的一部分，故可方便地用FCM检测出来。FCM通过单一或多种分析可以检测出细胞凋亡在代谢、生化及分子水平的表现，它可以对原代

14、培养的神经细胞或已固定的细胞凋亡进行快速、方便、精确的定量分析，而且可能阐明细胞凋亡与细胞周期的关系，较电泳方法灵敏度更高。目前利用FCM来测定神经细胞的报道并不多，因为在检测之前的处理过程中，很难制备出纯度很高的单神经细胞悬液，而且细胞碎片较多，直接影响检测结果，所以样本处理过程是决定结果可靠性的关键。在我们所做模型的检测结果中，显示脑组织细胞周期峰值及凋亡峰值的波动性都很大。因此，我们认为将FCM用于神经细胞检测时，其结果必须经统计学处理，以排除干扰因素的影响。将该方法与TUNEL、琼脂糖凝胶电泳及形态学观察相结合，可以更全面、多方位的确定凋亡细胞。3.2细胞凋亡与不同NOS抑制剂干扰后的

15、局灶性脑缺血再灌流的关系我们在用不同NOS抑制剂干扰后的大鼠局灶性脑缺血再灌流模型中利用形态学(光镜和电镜)、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL及FCM多种检测方法证实细胞凋亡现象普遍存在于局灶性脑缺血再灌流过程中，存在部位包括正常脑组织、缺血半影区及坏死中心区，但这些凋亡细胞在数量及生物学意义上有很大的差别。(1)正常脑组织：在我们测定的结果中，TUNEL显示仅在大脑皮层及海马中偶见阳性凋亡细胞，FCM测定神经细胞凋亡峰的出现率约为10%左右。其意义是生命过程中的一个正常生理现象，具有决定发育方向，使有多向发育趋势的前体细胞退化，以便集中分化为特定的细胞表型的作用。FCM结果还显示：神经细胞仅表现出

16、较高的G1期峰值，S期(DNA合成期)较低，而G2期和M期(细胞分裂期)几乎不出现，这与其它增殖型细胞的FCM结果不同。说明神经细胞作为终末分化的细胞，在生理过程中凋亡细胞出现率较低，而且一般不再进入细胞周期。(2)缺血半影区：局灶性脑缺血由严重缺血的中心区和处于低灌流状态的周围区(缺血半影区)组成。随着缺血时间的推移，缺血中心区和缺血半影区处于动态变化过程。缺血半影区的神经细胞具有电活动中止、功能失活但保持离子平衡和结构完整的特性，在有利条件下，缺血半影区可转化为正常灌流区(时限性可逆)，在不利情况下转化为梗死区(不可逆转)，并从缺血中心区向邻近组织扩散。我们的测定结果表明：缺血半影区的病理

17、改变以细胞凋亡为主(电镜、TUNEL)，大剂量的NOS抑制剂对该区的影响最明显，其凋亡峰明显高于实验1组(FCM)，而小剂量的NOS抑制剂则对该区无明显影响。其实质可能是NO具有改变神经细胞对慢性、不完全性缺血、缺氧耐受性的作用。因此，最初的生化改变是可逆的，但过量减少NO含量则有加重神经细胞损伤的作用，因该部位处于低灌流区内，所以其损伤以通过基因调控发生的主动自杀过程为主，表现为凋亡。(3)坏死中心区：随着缺血缺氧的加重和时限的延长，神经细胞出现坏死性改变，同时伴有凋亡细胞量的增加。实验1组坏死区的凋亡细胞量明显高于缺血半影区，给予小剂量NOS抑制剂干扰后则坏死区的凋亡细胞量明显低于缺血半影

18、区，而给予大剂量NOS抑制剂干扰后两者之间则没有明显差异，由此可见，凋亡与坏死的发生均与缺血缺氧的方式和神经细胞本身对缺血缺氧的敏感性及耐受性有关，慢性轻度的缺血缺氧则以细胞坏死为主。在急性严重的缺血缺氧时，适量减少NO含量能够避免坏死区神经细胞的进一步损伤。总之，细胞凋亡现象普遍存在于局灶性脑缺血再灌流过程中，存在部位包括正常脑组织、缺血半影区及坏死中心区，但这些凋亡细胞在数量及生物学意义上有很大的差别。在半影区内，过量减少NO含量具有加重神经细胞凋亡的作用，而在坏死区内，适量减少NO含量则有明显减少神经细胞凋亡的作用。(本文编校程门雪)基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670266)

19、作者单位：吕晓红(白求恩医科大学第一临床学院神经内科,吉林,长春,130021)吴军(白求恩医科大学第一临床学院神经内科,吉林,长春,130021)马玉刚(白求恩医科大学第一临床学院神经内科,吉林,长春,130021)饶明俐(白求恩医科大学第一临床学院神经内科,吉林,长春,130021)李广生(白求恩医科大学地方病研究所,吉林,长春.130021)参考文献：1Cotter TG,Lennon SV,Glynn JM,et al. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosisJ. Cancer Res,1992,52：997-1006.2Green DR,Cotter TG. Introduction：apoptosis in the immune systemJ. Semin Im