IP6对人结肠癌细胞HT

1、IP6对人结肠癌细胞HT29凋亡Caspase3基因作用【摘要】 目的 研究肌醇六磷酸（IP6）对人结肠癌细胞HT29的诱导凋亡作用，检测Caspase3基因在IP6处理细胞前后表达的变化，并对IP6诱导人结肠癌细胞HT29的凋亡机制进行初步探讨。方法 不同浓度的IP6以不同时间作用于体外培养的HT29细胞，用MTT法检测IP6持续作用对癌细胞增殖的影响；透射电镜观察癌细胞超微结构的变化；用RTPCR方法对IP6作用前后以及作用不同浓度和时间的癌细胞内Caspase3活性进行检测。结果 IP6能显著抑制人结肠癌细胞HT29生长，呈剂量与时间依赖性；IP6作用后，HT29细胞出现凋亡的形态学改变

2、；与对照组相比，不同浓度的IP6作用不同时间后，Caspase3 mRNA表达均升高（F=8.17391.755,q=3.96017.095，P0.05）, IP6作用6个月组Caspase3 mRNA表达升高较其他时间组显著（q=12.85814.890，P0.01）。结论 IP6具有抑制人结肠癌细胞HT29增殖和诱导凋亡的作用；IP6长期作用诱导细胞凋亡更加显著；Caspase3基因参与细胞的凋亡调节机制，发挥重要作用。 【关键词】 植酸 HT29细胞 细胞凋亡 基因 Caspase3IP6 INDUCES APOPTOSIS AND ENHANCES EXPRESSION OF Casp

3、ase3 IN HT29 HUMAN COLON CARCINOMA CELL LINESONG LI, SONG YANG(Institute of Nutrition, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China);ABSTRACT Objective To study the mechanisms of apoptosis induced by Inositol Hexaphosphate (IP6) in HT29 human colon carcinoma cell line. Methods HT29 cell

4、s cultured in vitro were exposed to various concentrations of IP6 applied at different time. The constant effect of IP6 on HT29 cells proliferation was evaluated by MTT assay. The morphological changes of HT29 cells were observed under electronic microscope.The activity of Caspase3 in HT29 cells was

5、 detected by RTPCR assay. Results IP6 remarkbly suppressed the growth of HT29 cells. The suppression was a dosedependent and timedependent manner. HT29 cells showed morphological changes of apoptosis after IP6 treatment.Compared with the control group, the expression of Caspase3 mRNA was significant

6、ly increased at all IP6 concentrations (F=8.173-91.755,q=3.960-17.095,P0.05). The upregulation of Caspase3 mRNA expression was significantly higher in the 6month group than the rest groups (q=12.858-14.890,P0.05），且具有时间效应关系。其中，与其他时间组相比，6个月组Caspase3 mRNA表达升高有统计学意义（q=12.85814.890，P0.05）。3 讨论 结肠癌是严重危害人类

7、健康的常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于肺癌和胃癌居第3位。一些流行病学资料表明，富含IP6的纤维食物对结肠癌具有预防作用，提示IP6具有预防结肠癌的功能2。有研究表明，IP6能选择性抑制肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡3,4。本实验应用MTT法研究显示，IP6对人结肠癌细胞HT29具有显著的增殖抑制作用，并且这一作用呈现出明显的剂量和时间依赖性。同时，在电镜下也观察了IP6作用后HT29细胞凋亡的超微结构变化。由此我们认为，IP6可能通过促进HT29细胞凋亡而实现其对细胞生长的抑制。 近几年国外资料表明，IP6可以通过调控细胞信号传导来抑制细胞的增殖，使细胞循环周期出现停滞，最终诱导细胞凋亡的发生5,

8、6。而通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活Caspase是细胞凋亡信号传导的主要途径之一。正常情况下Caspases在细胞内以无活性的酶原形式存在，当凋亡过程被启动后，凋亡信号可传导至Caspases酶原，使其部分肽链发生水解，形成有活性的Caspases，然后各种Caspases产生级联反应，最终诱导细胞发生凋亡。 表1 IP6不同浓度和时间对HT29细胞Caspase3 mRNA表达的影响（略）图1 IP6连续作用对HT29细胞增殖的影响（略）图2 透射电镜观察IP6作用后HT29细胞超微结构的变化（略） a:未经IP6作用的HT29细胞，未见凋亡小体（5 000）；b:3.3 mmol/L

9、IP6作用3 d的HT29细胞，可见凋亡小体（9 000）；c:3.3 mmol/L IP6作用6个月的HT29细胞，可见凋亡小体，细胞裂解多（3 000）图3 Caspase3 mRNA的表达（略） :DNA Marker；:分别为IP6 0、1.8、3.3 mmol/L作用3 d；:分别为IP6 0、1.8、3.3 mmol/L作用3个月；:分另为IP6 0、1.8、3.3 mmol/L作用6个月迄今已发现Caspase家族有16个成员，其中起核心作用的是Caspase3，是凋亡活动的主要参与成分。Caspase3被激活后可裂解产生相对分子质量1.7万的活性亚单位，后者可进一步激活Casp

10、ases活化的核酸内切酶（CAD），活化的CAD可切割DNA，导致细胞发生凋亡。在多种细胞的凋亡过程中均有Caspase3的活性的变化7,已有研究表明，IP6可诱导前列腺癌细胞系和宫颈癌细胞系的凋亡，参与凋亡相关酶Caspase9、Caspase3激活，IP6的这种作用具有时间和剂量依赖性4。我们的前期体外实验结果显示，IP6短期作用即可以抑制人结肠癌细胞系HT29的增殖，并诱导其凋亡，且具有剂量和时间效应关系，并对IP6作用后HT29细胞抑癌基因和癌基因的变化进行了初步探讨810。鉴于IP6是一种作用较温和的抗癌物质，其对结肠上皮细胞的保护作用是以一种潜在的、稳定的方式实现，其更大的作用在于

11、协同和预防作用，而治疗作用需要在一个较为长期的过程中去观察，因此，本实验在观察IP6短期作用的同时，还将不同剂量的IP6较长时间（3、6个月）作用于人结肠癌细胞系HT29，其结果显示，IP6能诱导HT29细胞发生凋亡，发挥出明显的体外抗结肠癌的作用；且IP6处理组细胞中 Caspase3的活性升高，其mRNA的表达较对照组明显升高，与对照组及其他作用时间组相比，IP6作用HF29细胞6个月Caspase3 mRNA表达升高明显。这均提示在IP6诱导的HT29细胞凋亡中，Caspase3可能参与了其信号的转导或者凋亡的控制；同时实验结果证实，随着IP6对HT29细胞的作用时间的延长，Caspas

12、e3的活性升高更加显著，提示IP6对HT29细胞的长期作用能更有效地诱导细胞凋亡，发挥抗结肠癌的作用，其中升高Caspase3活性可能是其诱导HT29细胞凋亡的重要作用机制之一，也说明IP6对结肠上皮细胞的保护作用需要在一个较为长期的过程中去观察，这为进一步研究提供了有力的实验依据。【参考文献】 1CHERYAN M. Phytic acid interactions in food systemJ. Crit Rev Food Sci Nutr, 1980,13:297335.2SHAMSUDDIN A M. Metabolish and cellular function of IP6:a

13、 reviewJ. Anticancer Res, 2011,19:37333736.3SAIED I T, SHAMSUDDIN A M. pregulation of the tumor suppressor gene p53 and WAF1 gene expression by IP6 in HT29 human colon carcinoma cell line J. Anticancer Res, 1998,18:14791484.4SINGH R P, AGARWAL C, AGARWAL R. Inositol hexaphosphate inhibits growth, an

14、d induces G1 arrest apoptotic death of prostate carcinoma DU145:modulation of CDKICDKcyclin and pRbrelatedproteinE2F complexesJ. Carsinogenesis, 2013,24:555563.5SHAMSUDDIIN A M, VUCENIK I, COLE K E. IP6: a novel anticancer agentJ. Life Sci, 1997,61:343354.6EL SHERBINY Y M, COX M C, ISMAIL Z A, et al

15、. G0/G1 arrest and S phase inhibition of human cancer cell lines by Inositolhexaphosphate (IP6)J. Anticancer Res, 2001,21:23932403.7刘希双,侯仁好,初晓艺. Bcl2与Caspase3蛋白在胃癌中的表达及其意义J. 青岛大学医学院学报, 2005,41(3)：232234.8张铮,宋扬,兰克涛. 植酸对大鼠结直肠癌形成的抑制作用与NK细胞变化关系的探讨J. 营养学报, 2004,26 (4)：308310.9宋扬,张海平. 肌醇六磷酸和膳食纤维对诱癌大鼠大肠癌发生的作用J. 营养学报, 2011