酶联免疫吸附试验

1、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 郭建惠 简简 介介19711971年，一位瑞典学者和一位荷兰学者分别报道将年，一位瑞典学者和一位荷兰学者分别报道将免疫技术发展为免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验定方法，称为酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)ELISA ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛，几乎所有的该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性可溶性抗原抗原- -抗抗体系统均可用以检测。体系统均可用以

2、检测。ELISAELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为根据已经使用的结果，认为ELISAELISA法具有灵敏、法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检

3、查几百甚至上千份标本一天之内可以检查几百甚至上千份标本, ,因此，因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 基基 本本 原原 理理l先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性并保持其免疫活性。l测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。骤与固相载体表面吸附

4、的抗体或抗原发生反应。l用洗涤的方法洗去多余的分离抗原用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复合物和抗体复合物和游离成分。游离成分。l 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。量测定。反反 应应 模模 式式酶联免疫吸附试验的主要技术类酶联免疫吸附试验的主要技术类型有型有双抗体夹心法双抗体夹心法、间接法、竞、间接法、竞争法、捕获法、生物素争法、捕获法、生物素-亲和素等。亲和素等。1 1，双抗体夹心法：，双抗体夹心法：此法常用于检测抗原此法常用于检测抗原它是检测抗原最常用的它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分，适用于检测分子中具有至少两个抗

5、原决定簇的多价抗原，而子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。不能用于小分子半抗原的检测。 2 2，间接法测定抗体，间接法测定抗体此法常用于测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原抗原-待待测抗体测抗体-酶标二抗的复合物酶标二抗的复合物，复合物的形成量，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。3 3，竞，竞 争争 法法此法既可用于检测抗原和半抗原的此法既可用于检测抗原和半抗原的定量测定

6、，也可用于测定抗体定量测定，也可用于测定抗体用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。度与待测物含量成反比。4 4，捕获法（反向间接法），捕获法（反向间接法）主要用于测定血清中某种抗体亚成分主要用于测定血清中某种抗体亚成分以目前最常用的以目前最

7、常用的IgM测定为例，因血清中针对测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性某种抗原的特异性IgM和和IgG同时存在，而后者同时存在，而后者可干扰可干扰IgM的测定。因此，先针对的测定。因此，先针对IgM的第二抗的第二抗体连接于固相载体，用以体连接于固相载体，用以“捕获捕获”样品中所有样品中所有IgM；洗涤除去；洗涤除去IgG等无关物质，然后加入特异等无关物质，然后加入特异性抗原与待测性抗原与待测IgM结合；再次加入抗原特异的结合；再次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二抗酶标抗体；最后形成固相二抗-IgM-抗原抗原-酶标酶标抗体复合物，加酶底物显色后，即可对待抗体复合物，加酶底物显色后，即可对

8、待IgM进行定性和定量测定。进行定性和定量测定。5 5，生物素，生物素- -亲和素亲和素 ABSABS为亲和素、生物素系统的略语。亲和素与为亲和素、生物素系统的略语。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1 1个个亲和素分子有亲和素分子有4 4个生物素分子的结合位置个生物素分子的结合位置，可，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与亲和素和生物素与ELISELIS偶联起

9、来，就可大提高偶联起来，就可大提高ELISAELISA的敏感度的敏感度。 这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISAELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素酶结合物，以放大反应信号。后连接亲和素酶结合物，以放大反应信号。 试剂组成：试剂组成： 1.包被板 ：包被有被检物质的抗原（抗体） 2.阴阳对照：主要为含被检物质的阴性阳性血清 3酶标工作液：HRP(辣根过氧化物酶) 4.底物液A、B：TMB(四甲基联苯胺） 5

10、.终止液：2M H2SO4 6.浓缩洗涤液:PBS(磷酸盐缓冲液 ）仪器：仪器： 1. 加样枪加样枪 2.37恒温水浴箱恒温水浴箱 3.PHOMO酶标仪酶标仪 2.加待检样本加待检样本：孵育使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 具具 体体 步步 骤骤1.包被包被:将特异性抗体包被固相载体孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质4.加入底物加入底物：显色固相上的酶催化底物产生有色产物通过比色，测标本中抗原的量。3.加入酶标抗体加入酶标抗体：孵育，使形成固相抗体待测抗原酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。5.加入终止加入

11、终止：终止反应6.结果判定结果判定：将酶标板放入酶标仪中，根据要求调整测量波长,在根据开单要求报定性定量值即可。1 1 标本的影响标本的影响 l溶血，脂血标本清溶血，脂血标本清ELISAELISA法检测易产生假阳性法检测易产生假阳性 l标本受细菌污染标本受细菌污染 l标本保存不当标本保存不当l塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性内会使样本内抗原含量下降造成假阴性l标本凝固不全标本凝固不全 2 2 试试 剂剂 影影 响响 ELISAELISA检测试剂厂家较多；因选用国家批准文检测试剂厂家较多；因选用国家批准文号，不同厂

12、家出产的试剂灵敏度与特异性存在号，不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，使用质劣的试剂必然导致结果的一定的差别，使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。试剂因妥善保管在假阳性或假阴性。试剂因妥善保管在4 4冰箱冰箱内，使用前要想平衡室温。不同批号试剂不能内，使用前要想平衡室温。不同批号试剂不能混用。因此，选择高质量的试剂是保证结果准混用。因此，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。确的关键之一。 3 3 操作技术的影响操作技术的影响l吸量的准确性吸量的准确性 吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，定期校准清洗，定

13、期校准 l温浴影响温浴影响抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求。抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求。 l加样次序影响加样次序影响 有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分离好后再加标本，这样常常会造成假阴性。等标本分离好后再加标本，这样常常会造成假阴性。l洗涤方法对结果的影响洗涤方法对结果的影响 洗涤是洗涤是ELISAELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动

14、洗板机使用不当也会影响结果结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果4 4 干扰物质的影响干扰物质的影响 大约大约40%40%的人血清标本中含有非特异性干扰的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果物质，可以不同程度影响检测结果 ；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等应物质和其他物质等药物的影响：如有些高效价的免疫球蛋白等药物的影响：如有些高效价的免疫球蛋白等应应 用用ELISA ELISA 法由于测定灵敏、特异、操作简便、法由于测定灵敏、特异、操作简便、酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反射性污染，且易与其他相关技术偶联，使射性污染，且易与其他相关技术偶联，使其成为目前应用最广泛