SN∕T 5439.5-2022 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法 第5部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌O157

1、 ICS67.050CCSC53中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5439.52022出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法第5部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌 O157RapiddetectionoffoodbornepathogensfromexportedfoodbyPCR-LateralflowdipstickmethodPart5:Shigatoxin-producingEscherichiacoliandEscherichiacoliO1572022-03-14发布2022-10-01实施 SN/T5439.52022前言本文件按照 GBT1.1/

2、2020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是SN/T5439的第5部分。SN/T5439已经发布了以下部分 :第1部分:沙门氏菌;第2部分:金黄色葡萄球菌 ;第3部分:副溶血性弧菌 ;第4部分:克罗诺杆菌;第5部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌 O157;第6部分:空肠弯曲菌;第7部分:单核细胞增生李斯特氏菌 。 SN/T5439.52022出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法 第5部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌 O157范围1本文件规定了出口食品中食源性 致病菌产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌O157 快速检-测的P

3、CR-试纸条方法。本文件适用于出口食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌 O157的定性检测。规范性引用文件2下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必 不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。GB4789.362016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌 O157H7NM: /检验/GBT6682分析实验室用水规格和试验方法/GBT274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T47812017出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法实时荧光PCR法术语

4、和定义3下列术语和定义适用于本文件 。3.1产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscheriacoli含有志贺毒素编码基因 stx的大肠埃希氏菌 ,stx有两大类: 和 。stx1 stx23.2大肠埃希氏菌O157:H7EscherichiacoliO157:H7其是一种革兰氏阴性菌,短杆菌,两端呈钝圆形的无芽孢菌,属于埃希氏菌属,是一种常见的病原菌。缩略语4下列缩略语适用于本文件 。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸 (deoxyribonuleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(et

5、hylenediaminetetraaceticacid)FITC:异硫氰酸盐(fluorescein5-isothiocyanate)Tris:三羟甲基氨基甲烷 ()trishydroxymethylaminomethane1 SN/T5439.52022方法原理5对样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌(O157)进行增菌培养后提取DNA,采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的 stx1stx2、 及O157特异性检测引物进行 PCR扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体 ,可与PCR产物上的异硫氰酸盐标记分子结合,在检测线位置上有抗地高辛抗体,可与PCR产物上的地高辛标记分子

6、结合,从而显色。如模板未扩增,则无PCR 产物与地高辛抗体及 FITC抗体结合,从而不能在检测线 (T线)位置显示颜色 。试剂和材料6除另有规定外 ,试剂为分析纯或生化试剂 ,实验用水符合 GBT6682/ 的要求。引物6.1扩增引物详见表 1,靶基因序列参见附录 A。表1试验用引物致病菌种类引物序列(53)5端标记物靶基因片段长度F:5-YAGTTGAGGGGGGTAAAATG-3R:5-CGRAAAATAACYTCGCTGAATC-3F:5-ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG-3R:5-GCGTCATCGTATACACAGGAGC-3F:5-CGGACATCCATGTGATATG

7、G-3R:5-TTGCCTATGTACAGCTAATCC-3地高辛stx1 282283bp异硫氰酸盐地高辛产志贺毒素大肠埃希氏菌stx2584bp259bp异硫氰酸盐地高辛大肠埃希氏菌rfbEO157异硫氰酸盐试剂6.26.2.1 DNA提取液:20mmoLLTris-HCl2mmolLEDTA1.2%TritonX-100pH8.0/, /,( )。6.2.2 2PCR预混液。6.2.3 PCR引物。试纸条:通过采购的原料试剂自行组装 (参见附录B),或采用等效的商品化试纸条 。6.2.46.2.5展开液: / 、 、 (体积分数)Tween20以及浓度为0.05molL/的10mmolL

8、Tris1%BSA1%NaOH;或采用等效的商品化产品 。仪器设备77.1离心机:离心力12000g。微量移液器: 。100L1000 L20 L200 L0.5 L10 L ,7.27.3 PCR仪。恒温水浴锅:1001。7.42 SN/T5439.520227.5天平:感量0.01g。7.6 pH计。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。7.7检验步骤8样品制备和增菌8.1产志贺毒素大肠埃希氏菌按照 SN/T47812017进行样品制备和增菌 ,大肠埃希氏菌O157按照GB4789.362016进行样品制备和增菌 。8.2样品 DNA提取8.2.1增菌液模板 DNA的制备对于7.1获得的增菌液

9、 ,采用如下方法制备模板 DNA:a)吸取1mL菌液加入1.5mL离心管中,12000g离心3min,弃上清。b)加入1mL0.85%无菌生理盐水 ,完全溶解沉淀 ,12000g离心3min,弃上清;c)加入100LDNA提取液混匀后沸水浴 10min,置冰上冷却;d)12000g 2min离心 ,上清液即为模板 DNA。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸 。8.2.2可疑菌落模板 DNA的制备对于7.1分离到的可疑菌落 ,可直接挑取可疑菌落再按照 7.2.1c)步骤制备模板 DNA以待检测。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸 。8.3 DNA浓度和纯度的测

10、定取5LDNA溶液加双蒸水稀释至 ,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测1mL260nm和280nm处的吸光值 A260 A DNA和 。 的浓度按公式()1计算:280/c=AN501000( 1)式中:cDNA浓度,单位为纳克每微升 (/ );ng LA260nm处的吸光值;N核酸稀释倍数 。当 / 280比值在1.71.9之间时,适宜于PCR扩增。A A2608.4 PCR扩增8.4.1 PCR反应体系见表2、表3。3 SN/T5439.52022表2 PCR反应体系(stx1/stx2)组分总体积(25L)2xPCR预混液12.5L0.25L0.25L5L上游引物 (10molL

11、/)下游引物 (10molL/)DNA模板a无菌水7LaDNA模板的浓度限定在 10pg/L10n/Lg之间。表3 PCR反应体系(rfbE)组分总体积(30L)2xPCR预混液15L1L1L10L3L上游引物(10molL/)下游引物(10molL/)DNA模板无菌水aDNA模板的浓度限定在 10pg/L10n/Lg之间。反应条件8.4.2stx1反应条件:95预变性 ; 延伸 ,个循环后进5min95 30s52 30s72 1min35变性 ,退火 ,入72,7min4; 保存。stx2反应条件:95预变性 ;变性 , 延伸 ,个循环后进退火 ,5min95 30s60 30s72 1m

12、in35入72,7min4; 保存。rfbE反应条件:95预变性 ;变性 , 延伸 ,个循环后进退火 ,5min95 30s55 30s72 1min35入72,7min4; 保存。检测过程中分别设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。对于产志贺毒素大肠埃希氏菌 ,用产志贺毒素大肠埃希氏菌 DNA模板作阳性对照 ,用非产志贺毒素大肠埃希氏菌DNA模板作阴性对照, 用等体积的无菌水代替模板 DNA作空白对照。对于大肠埃希氏菌 O157,用大肠埃希氏菌 O157DNA模板作阳性对照,用非大肠埃希氏菌O157DNA模板作阴性对照,用等体积的无菌水代替模板DNA 作空白对照。试纸条检测8.4.3取6LPC

13、R产物,加入54L上样稀释液,混匀后垂直缓慢滴加于试条样品垫中,结果。3min观察质量控制9以下条件有一条不满足时 ,实验视为无效 :a)空白对照:质控线变红,检测线未变红 ;4 SN/T5439.52022b)阴性对照:质控线变红,检测线未变红 ;c)阳性对照:质控线变红,检测线变红。结果判断与表述10结果判定10.1试纸条质控线变红色,且检测线变红色,PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证。试纸条质控线变红色 ,检测线不变色 ,PCR扩增产物为阴性 。表述10.2PCR产物试纸条检测为可疑阳性 ,同时测序结果正确者 ,继续按照传统方法进行分离 。对于产志贺毒素大肠埃希氏菌,按

14、照附录C的步骤进行菌株分离确证 ;对于大肠埃希氏菌 O157,按照GB4789.362016进行菌株分离确证。若确分离到该菌,判为含产志贺毒素大肠埃希氏菌或大肠埃希氏菌 O157,表述为检出产志贺毒素大肠埃希氏菌或大肠埃希氏菌 O157。PCR产物试纸条检测为阴性 ,判为不含有产志贺毒素大肠埃希氏菌或大肠埃希氏菌 O157,表述为未检出产志贺毒素大肠埃希氏菌或大肠埃希氏菌 O157。检测过程中防止交叉污染的措施1112GBT274032008按照 /中附录D的规定执行。废弃物处理检测过程中的废弃物 ,收集后在焚烧炉中焚烧处理 。检出限13本文件所规定方法的产志贺毒素大肠埃希氏菌最低检出限 (

15、)为LOD 10CFUmLO1573/ ,最低检出限为1/ 。10CFUmL5 SN/T5439.52022附录A(资料性)PCR产物测序结果基因扩增靶标参考序列如下所示 。stx1M16625( )CAGTTGAGGGGGTAAAATGAAAAAAACATTATTAATAGCTGCATCGCTTTCATTTTTTTCAGCAAGTGCGCTGGCGACGCCTGATTGTGTAACTGGAAAGGTGGAGTATACAAAATATAATGATGACGATACCTTTACAGTTAAAGTGGGTGATAAAGAATTATTTACCAACAGATGGAATCTTCAGTCTCTTCTTCTCA

16、GTGCGCAAATTACGGGGATGACTGTAACCATTAAAACTAATGCCTGTCATAATGGAGGGGGATTCAGCGAAGTTATTTTTCGstx1AJ413986( )CAGTTGAGGGGGGTAAAATGAAAAAAATATTATTAATAGCTGCATCACTTTCATTTTTTTCAGCAAGTGTGCTGGCTGCGCCAGATTGTGTAACTGGGAAGGTGGAGTATACAAAATATAATGATGACGATACCTTTACAGTTAAAGTGGGAGATAAAGAATTATTTACTAACAGATGGAATCTTCAGTCTCTTCTTCTCAGT

17、GCACAAATTACGGGGATGACGGTAACCATTAAAACTAATGCCTGTCATAATGGAGGGGGATTCAGCGAGGTTATTTTCCGstx2NC002695.21267107-1268066( _ ):ATCCTATTCCCGGGAGTTTACGATAGACTTTTCGACCCAACAAAGTTATGTCTCTTCGTTAAATAGTATACGGACAGAGATATCGACCCCTCTTGAACATATATCTCAGGGGACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACGAGGGCTTGATG

18、TCTATCAGGCGCGTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAGCAAAATAATTTATATGTGGCCGGGTTCGTTAATACGGCAACAAATACTTTCTACCGTTTTTCAGATTTTACACATATATCAGTGCCCGGTGTGACAACGGTTTCCATGACAACGGACAGCAGTTATACCACTCTGCAACGTGTCGCAGCGCTGGAACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGTCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGTTAATGGAGTTCAGTGGTAATACAATGACCAGAGATGCATCCAGAGCAGTTC

19、TGCGTTTTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGCTTCAGGCAGATACAGAGAGAATTTCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCCTGTGTATACGATGACGCrfbE(JQ907523.1)CGGACATCCATGTGATATGGAACAAATTGTAGAACTGGCCAAAAGTAGAAATTTGTTTGTAATTGAAGATTGCGCTGAAGCCTTTGGTTCTAAATATAAAGGTAAATATGTGGGAACATTTGGAGATATTTCTACTTTTAGCTTTTTTGGAAATAAAACTATTACTACAGGTGAAGGTGGAA

20、TGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAA6 SN/T5439.52022附录B(资料性)含有金标记的抗 FITC的单克隆抗体和固定有地高辛抗体的通用核酸检测试纸条组成成分B.1地高辛抗体。羊抗鼠二抗。B.1.1B.1.2B.1.3 FITC抗体。/()。B.1.4 1molLTris-HClpH=8.0B.1.5 10%蔗糖溶液。B.1.6 0.1molL/碳酸钾( )溶液。KCO23B.1.7 1%柠檬酸三钠溶液 。B.1.8 0.2molL/磷酸盐缓冲液(PB)。B.1.9 1

21、0%牛血清白蛋白(BSA)溶液。金标垫处理液 :蔗糖、吐温20、海藻糖、和/ ( )。B.1.10B.1.11B.1.12B.1.13B.1.14PEG2000 0.01molLPBpH7.4样品垫处理液 :曲拉通 、 、-100NaClTris-HClPH8.0 0.01molLPBPH7.4( )和 / ( )。聚酯膜。硝酸纤维膜(NC膜)。吸水纸。B.1.15 PVC底板。试纸条结构B.2见图B.1。标引序号说明 :1吸水滤纸垫 ;2结合物垫,附有FITC抗体与胶体金颗粒的交联体 ;3侧向层析基质 (硝酸纤维素膜 );4检测带,附有地高辛抗体 ;5质控带,附有羊抗鼠二抗 ;6衬底;7吸水

22、垫。图 B.1试纸条结构试纸条的制备B.3试纸条材料准备B.3.1制金:利用柠檬酸三钠作为还原剂把氯金酸还原为单质金的方法制备金纳米粒子。 准备干B.3.1.1净的锥形瓶和搅拌子 ,向锥形瓶中加入双蒸水和氯金酸并置于磁力加热搅拌器上加热 ,待瓶中液体沸腾7 SN/T5439.52022后,加入柠檬酸三钠溶液 (最好现配现用),边继续加热边搅拌 ,直到瓶内液体状态变为透明的酒红色 ,即为制得的金纳米粒子 (需质控金纳米粒子粒径为 15nm40nm),关闭热源后继续搅拌 5min持为透明酒红色不变后停止 ,取下锥形瓶待冷却后取出搅拌子 ,金纳米粒子置于 28保存备用。金标垫制作:聚酯膜裁切成 (至

23、液体保B.3.1.2中浸泡2h,再取出烘干备用 。B.3.1.3样品垫制作:聚酯膜板裁切成 17mm300mm(宽长)长条于样品垫处理液中浸泡 ,再65mm75mm)300mm(宽长)的预处理膜于金标处理液2h取出放置烘箱中烘干备用 。B.3.1.4吸水垫制作:将纸板用定位裁切机裁切 19mm300mm(宽长)长条备用。B.3.1.5胶体金标记 FITC抗体:取上述制备的 1mL胶体金经3溶液调节pH后,加入KCO FITC2抗体工作液,充分混匀后置于室温振荡反应 ,再向溶液中加入10%的BSA溶液继续振荡反应, / ,沉淀重悬于 BSA溶液中28保存备用。1h30min9800rmin4离心

24、10min喷金:利用喷金划膜仪将上述制备好的金标记抗体的重悬液喷至准备好的金标垫上 (最终每个B.3.1.6金标垫上的金标抗体重悬液的量约为 6L7L),再置于37烘箱中烘干,裁剪(6mm7mm)300mm(宽长)备用。划膜:制备羊抗鼠二抗 (H+L)和地高辛抗体工作液,再将其通过喷金划膜仪喷至硝酸纤维B.3.1.7膜上,即制得印有分别代表质控线和检测线的两条隐形印迹线的 NC膜,再置于37烘箱中烘干备用 。试纸条的组装B.3.2依次将上述制备好的样品垫 、金标垫、NC膜和吸水垫粘于底板上,每部分衔接处多出2mm,于切条机上切成(6mm7mm)4mm(宽长)即为所制的试纸条 ,质控合格后置于恒

25、温恒湿箱中密封保存备用。试纸条检测原理B.4对样品中致病菌增菌培养提取 DNA,采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的致病菌特异性检测引物进行 PCR扩增,阳性扩增产物的两端会分别带有地高辛 和FITC。检测用试纸条上在吸水垫上含有金标记的 FITC单克隆抗体,可与PCR产物一条链上的FITC标记分子结合,在T检测线位置上固定有抗地高辛抗体 ,可与PCR产物另一条链上的地高辛标记分子结合 。在展开液的作用下,PCR扩增产物首先与金标记的 FITC抗体结合,通过毛细作用带动胶体金向 前端移动,在经过固定有地高辛抗体的检测线位置时 ,因带有地高辛标记而被地高辛抗体捕 获在该位置上,显示棕红色,过量的金偶联物继续向上移动至固定有羊抗鼠二抗的C质控线位置,与二抗结合,从而显示出两条色带。如模板未扩增 ,则无PCR产物与地高辛抗体及FITC抗体结合,从而不能在检测线(T线)位置显示颜色。未参与反应的胶体金偶联物 ,向上一直扩散至