疫苗生产的细胞培养

1、疫苗生产的细胞培养和残留物 病毒毒种 细胞培养体系 添加剂及残留物控制Requirements of an Effective Vaccine安全：安全： 疫苗必须保证不引疫苗必须保证不引发疾病和死亡发疾病和死亡价廉：价廉：价格低廉，价格低廉，WHO概算不概算不超过超过$1/剂剂有效：有效： 疫苗能诱导天然、体液和细胞免疫苗能诱导天然、体液和细胞免 疫反应，并且至少应保持几年疫反应，并且至少应保持几年方便： 疫苗稳定、方便储运、方便给药，利益大于风险 病毒性灭活疫苗 关键点1 (病毒种子)Latent/occult viruses of safety concernin vaccine cel

2、l substrates逆转录病毒逆转录病毒： 逆转录病毒(内源或外源引入) 逆转录病毒属(禽白血病病毒, ALV) 逆转录病毒属(猴逆转录病毒,MPMV/SRV) 逆转录病毒属(小鼠白血病病毒, MLV)RNA 病毒：病毒： 沙粒病毒 脉络丛脑膜炎(LCMV)DNA病毒：腺病毒相关病毒 Hepadenaviruses（肝DNA病毒属，包括鸭肝炎病毒） 疱疹病毒 乳头瘤病毒属 多瘤病毒属轮状疫苗的猪圆环病毒污染 GSK 的轮状疫苗污染PCV1，其IPV的毒种污染PCV1的DNA，3.81031.9107 /ml MERCK D的轮状病毒疫苗存在PCV2均为Vero细胞生产的疫苗 PCV1不引起

3、猪或人类疾病PCV2与猪断奶后多脏器衰歇综合征有关来自疫苗的PCV1的222（A-G）和706（T-G）导致172位的aa由（异亮氨酸苏氨酸）推测该污染PCV1可能已适应Vero细胞 baboon endogenous and Flockhouse virus（狒狒内源性病毒和昆虫病毒的污染）逆转录病毒昆虫病毒的污然 宿主细胞残余DNA生长因子生长因子 Growth-promoting proteins 生长因子可被生产生物制品用的细胞基质分泌；但目前认为风险较小生长促进作用短暂和可逆本身不能自我复制许多生长因子在体内较快失活在特殊环境下，生长因子可促使细胞的肿瘤化，但细胞的肿瘤化依赖生长因子

4、的持续分泌和存在，至今尚未发现已用于生物制品生产的细胞培养基质具有这种能力干细胞 可分泌高水平的生长因子 高活性和高促生长能力 在使用干细胞制备生物制品的研究中须高度重视生长因子的风险细胞基质 原代细胞 优点：1、可以使用较简单的培养基和牛血清制备获得，2、对大多数病毒均敏感适应，可产生细胞病变容易观察。缺点：1、最大的缺点是污染外源性感染因子，如病毒；2、从不同的动物所获得的培养物对扩增病毒的敏感性和质 量可能不同；3、非人灵长类动物很难获得；4、获得的动物脏器所制备的细胞往往是多种类细胞，不同 批次不能保证获得的细胞的一致性。原代细胞制备用动物SPF (specific-pathogen-

5、free) “closed” “封闭群” animal husbandry without any introduction of new animals fromoutside the maintained group prevents introduction of geneticallytransmittedviral elements (e.g., retroviral proviruses). Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of

6、biological medicinal products and for the characterization of cell banks，Proposed replacement of TRS 878, Annex 1，WHO 2008动物种群在5年以上未从外部引进其他新血缘品系，是由同一血缘品系进行随意交配，并在固定场所保存繁殖的动物群。（实验动物质量控制）方喜业等，中国标准出版社，2008年）以非近亲交配方式进行繁殖生产的实验动物种群,在不从外部引入新个体的条件下,至少连续繁殖4代以上,称为一个封闭群,或叫远交群（医学试验动物学）细胞基质 二倍体细胞优点1、具有非常好的特性而且已经

7、标准化，2、可以建立细胞库系统，细胞群体的一致性和重现性好，3、细胞库包括MCB和WCB，以群体倍增（population doubling） 和传代水平（passage levels）控制细胞，4、没有如CCLs 和SCLs安全性和致肿瘤性。 缺点1、很难用于大规模生产，如微载体和悬浮培养, 目前已有应用的报道；2、比其他的细胞培养基条件更高；3、需要更多的牛血清；4、很难适应到无血清培养基；5、很难进行基因工程改造。细胞基质 二倍体细胞传代（传代（Passage number ）次代培养或传代的次数，该传代过程应定期按比率或稀释度进行，可以确定相对的培养年龄（代次） 群体倍增（群体倍增（P

8、opulation doubling）群体细胞数量增加至两倍 群体倍增时间（Population doubling time ）计算对数生长期时如从1.0 X 106到2.0 X 106个细胞的时间间隔，它与细胞世代时间不同义（不是真正意义上的一个细胞扩增至两个，其关键在“群体”） 细胞世代时间（细胞世代时间（Cell generation time）一个细胞分裂至两个的连续的时间段，该时间可以用显微照相术确定，但与群体倍增时间不同义。群体倍增水平（群体倍增水平（Population doubling level ）一个细胞系（株）从其最初的体外培养开始的群体倍增的总次数成活力（成活力（Via

9、bility） 80 （指冻存细胞的复苏状况）低存活率的细胞库复苏将使群体倍增时间延长，表面看传代次数不增加，但实际上细胞的群体倍增水平增加，导致细胞潜在的突变风险。Schaeffer WI et al; Terminology Associated with Cell, Tissue and Organ Culture, Molecular Biology and Molecular Genetics,In vitro Cell. Dev. Biol. 26:97-101, January 1990二倍体细胞生产疫苗细胞基质 传代细胞优点1、具有非常好的特性而且已经标准化，2、可以建立细胞库

10、系统，细胞群体的一致性和重现性好，而且可以无限的，3、较低的培养基营养条件，4、能适应无血清培养基，5、可使用大规模生物反应器微载体培养，6、有些细胞可以用悬浮培养 缺点1、含有和表达内源病毒，有些细胞本身是肿瘤细胞，2、残留细胞DNA由于具有生物活性，所以具有感染和致瘤的理论风险，3、小RNA (miRNA)调节基因作用的理论风险，4、含有的转化蛋白可以使正常细胞转化为肿瘤细胞的理论风险。美国FDA对Vero细胞用于疫苗研制的建议2002年5月20日发表对以Vero细胞为基质的病毒性疫苗研制者的信。CBER的意见认为Vero细胞作为病毒性疫苗的培养用细胞基质是可以行的美国FDA对Vero细胞

11、用于疫苗研制的建议Vero细胞生产的产品须无完整的Vero细胞虽然WHO目前已接受注射用传代细胞产品DNA残余量不超过10ng/剂。CBER建议须继续关注产品中Vero细胞残余DNA的量。残余Vero细胞DNA的风险水平应按不同情况不同处理，要考虑疫苗的给药方法，如注射、粘膜或其他途径。因此CBER建议：要确定终产品中残余细胞DNA的量和DNA的大小，应该在疫苗终产品中描述每人用剂量中含残余DNA的量。由于使用了各种不同的处理方法（如DNA酶处理）细胞残余DNA的量和大小可进一步下降，要评价已加入的生产工艺或考虑要加入的生产工艺以其减少DNA，应注意由于改变工艺而引起潜在的产品质量的影响（如免

12、疫原性） 残余物与添加剂残余细胞DNA（rcDNA）1、感染活性细胞DNA中含有感染性病毒基因，1）DNA病毒插入的病毒基因或染色体外基因，2）逆转录病毒的前病毒DNA。2、致肿瘤性（oncogenicity）1）病毒基因一旦引入细胞，可能被扩增继而产生病毒颗粒，2）50pg多瘤病毒DNA即可致小鼠发生肿瘤，1pg的逆转录病毒前病毒DNA可使小鼠发生肿瘤为何对DNA表示担忧原因1、细胞可能含有1) 致肿瘤基因2) 整合在细胞基因中的病毒基因2、生产疫苗用的细胞基因会带入疫苗终产品中3、产品中的DNA通过注射进入使用者体内导致的肿瘤病原体感染结果1、感染2、诱发肿瘤1）肿瘤基因的表达2）原癌基因

13、的激活3）肿瘤抑制基因的关闭（失去功能）3、突变基因的插入激活、抑制功能丧失、正负调节功能的破坏去除或/和灭活rcDNA1、在生产过程中任何减少rcDNA的量，2、在生产过程中任何减小rcDNA片断的大小3、在生产过程中使用任何化学物质对rcDNA生物活性的灭活beta-propiolactone的灭活作用，DNA酶的消化处理经口或鼻途径给药的产品，其DNA应与NRA/NCA磋商，但肠溶产品应严格考虑./ohrms/dockets/ac/08/slides/2008-4384S1_3.pdf/cber/advisory/adv

14、isory.htmlPierre Perrin* and Sylvie Morgeaux，Inactivation of DNA by b-propiolactoneBiologicals (1995) 23, 207211-丙内酯灭活病毒（裂解DNA/RNA）的原理-丙内酯（BPL）是一种烷化剂，能与包括核酸在内的许多亲核物质反应，PL对核酸的反应主要与嘌呤残基结构的修饰（特别是鸟嘌呤）。它诱导DNA链打开缺口，使DNA和蛋白质之间，以及双螺旋结构的DNA链之间发生交联。因此，BPL被广泛用于灭活病毒（DNA和RNA病毒）。此外，改变各种聚合酶对残留/污染细胞DNA作为模板的能力，BPL用于

15、降低残留/污染的细胞DNA生物制剂的风险。疫苗的添加剂牛血清牛血清-血清中的主要成分血清中的主要成分疫苗的添加剂是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂，纯化过程中已基本去除，质量标准50 n g/剂.最担心疯牛病（传染性海绵状脑病、T S E）WHO ：人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或其他制品的研讨会报告（1997. 3）Report of a WHO Consultation on Medicinal and Other Products inRelation to Human and Animal Transmissible SpongiformEncephalitis疫苗的添加剂

16、1、1980年-1996年在英国居住满3个月者2、1980年-1990年在北欧的军事基地居住满3个月或在南欧满6个月以上。3、1980年-目前在法国居住满5年以上4、自1980年以来接受过输血的人员。5、自1980年-目前在欧洲居住满5年以上者。以上人员不能献全血，但可以献血浆，因为白蛋白的制备过程能去掉海绵状脑病的致病因子；而英国、法国人两者均不能。WWW./cber/gdlns/cjdvcjdq&a.htmRevised preventive measures to reduce the possible risk of transmission of Creutzfeldt-Jakob(CJD) Diseaseand Variant Creutzfeldt-Jakob Disease by blood and blood product,Final FDA guidance document,疫苗的添加剂国际上趋势：疫苗中尽可能不用明胶 冻干疫苗中冻干保护剂使用明胶： 动物源性明胶 猪源性明胶 牛源性明胶 牛皮源性明胶 牛骨源性明胶 绝不能使用头骨和脊髓骨indicate otherwise