基因工程工程菌构建实用教案

1、 1，3丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株备被认为是今后的发展(fzhn)方向。1，3丙二醇简介(jin ji)第1页/共28页第一页，共29页。1，3-丙二醇性质(xngzh)物理性质：1，3丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相对

2、密度为1053 gcm3，熔点27，沸点211，自燃(z rn)温度为400。化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。第2页/共28页第二页，共29页。1 1，3-3-丙二醇用途(yngt)(yngt) 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业14j。 1，3丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝(chn s)产品，产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料第3页/共

3、28页第三页，共29页。1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期(yq)目标本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克隆116 kb的1，3丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD280kb来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建了重组菌 i JM109(pEtacdhaBtac-yqhD) 构建重组载体(zit)pUCtacdhaT，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT，研究为提高1，3丙二醇产量提供了新途径。 第4页/共28页第四页，共29页。1，3-丙二醇基因工程(jyn gngchng)菌构建的路线(1)串联表达来源于克雷伯氏菌

4、(Klebsiella)编码油脱水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建(u jin) 重组菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD);考察其转化甘油的能力。(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化还原酶dhaT，构建(u jin)重组载体pUCtac一砌口T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT。(3)在摇瓶水平，对已构建(u jin)的产1，3丙二醇重组菌EcoliJMl09 发酵条件的初步研第5页/共28页第五页，共29页。 1，3丙二醇生物合

5、成途径 l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着(yn zhe)氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇 。 第6页/共28页第六页，共29页。一、大肠杆菌JMl09的构建(u jin)及其表达第7页/共28页第七页，共29页。 1，菌株、质粒及基因片断： 大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠 杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到

6、(d do)。 2，主要试剂： 质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 材料(cilio)第8页/共28页第八页，共29页。（一）、质粒DNA的提取(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养(piyng)基中，振荡培养(piyng)过夜。(2)取15mL菌液于Eppendorf管中，6000rmin离心5 min。(3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。(4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。(5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 rmin，离心10min。(6)将420L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤5中的上清加入离心吸

7、附柱中混匀，第9页/共28页第九页，共29页。6000 rmin离心30s。倒掉废液收集管中的废液。（7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000rmin离心30s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 rmin离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净(gnjng)的15 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置25min后，6000 rmin离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。第10页/共28页第十页，共29页。(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备(1)接种EcoliJM1

8、09于LB培养基中振荡培养过夜。(2)取05mL培养液于50mLLB培养基中37振荡培养至OD值O304。(3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却(lngqu)约10分钟。(4)分装菌液到Eppendorf管(15mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。(5)8000rmin离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL， 第11页/共28页第十一页，共29页。 轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。（6)重复步骤(5)两次。 (7)8000rmin离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL

9、。也可加40 uL50的甘油保存(bocn)代用。第12页/共28页第十二页，共29页。（三）、转化(zhunhu)大肠杆菌(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。(2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可用漩涡混合仪。(3)冰水浴40min。(4)42热激90s。(5)加入1mL LB培养基，37震荡培养12 h。(6)涂布含有相应(xingyng)抗生素的LB平板。第13页/共28页第十三页，共29页。（四）、大肠杆菌(d chn n jn)JMl09基因工程菌的构建 首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD连入载体pEtac上，得到(d do)重组质粒pEtac-yqhD，经酶切，得到(d

10、 do)片段tac-yqhD连入载体pUCl9，得到(d do)重组质粒pUCtac-yqhD，将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体pUCtac-yqhD，以得到(d do)的重组质粒pUCdhaBtac-yqhD。将重组表达载体酶切连接到pEtac上，得到(d do)双启动子重组表达大肠杆菌JM 109(pEtacdhaB-tac-yqhD)。第14页/共28页第十四页，共29页。（五）、酶活力(hul)测定 1、甘油脱水酶活力(hul)的测定2、1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的酶 活力(hul)测定第15页/共28页第十五页，共29页。（六）、1，3丙二醇含量(hnling)的测定

11、 发酵液中l，3：丙二醇及甘油的含量采用气相色谱测定 ，国产高分子微GDX401(110目)为固定相。柱温：250，进样温度：240，检测温度t 240，氮气作为载气，使用氢火焰(huyn)检测器，进样5“L，1，3丙二醇的保留时间为27 min左右，用外标法计算发酵液中1，3一丙二醇的含量。第16页/共28页第十六页，共29页。二、重组质粒pUCtac-dhaT的构建(u jin)及其与pEtacdhaBtac-yqhD在大肠杆菌JMl09中共表达第17页/共28页第十七页，共29页。实验材料 菌种：E coliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD)为本研究“第二章构建保存的；质

12、粒pUCl9，pEtac由本实验室保藏：dhaT基因从克雷伯氏菌中 试剂和工具酶：质粒小量抽提试剂盒、胶回收(hushu)试剂盒、质粒纯化试剂盒 工具酶、抗生素 公司、华美生物 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布的序列， 。 第18页/共28页第十八页，共29页。 引物： 3PCR引物 根据(gnj)克雷伯氏菌公布的序列，设计片段pEtacdhaTPCR所需引物：Ps：5-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3：P6：5-ACC CAGAATGCCTGGCG3。引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点。第19页/共28页第十九页，共

13、29页。实验条件和方法 PCR反应体系及反应条件：PCR反应体系：在0 5 mL Eppendorf管中按顺序加入以下试剂：10buffer 5 m，2 5mmolLdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1 IIl，模板DNA2 pl，脚酶1 itl，ddH20 32m，总体积50 pl。 13一丙二醇氧化还原酶dhaT的反应条件：94预变性5min：变性90 s，54退火(tu hu)l 5min，72延伸l 5rain，循环35次；72保温10min。 第20页/共28页第二十页，共29页。 （1）大肠杆菌基因工程菌的构建将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT连入载体(zit)p

14、Etae，以得到的重组质粒pEtac-dhaT。经酶切得到片段tac-dhaT连接到pUCl9上，以得到的重组质粒pUC-tac-dhaT。将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。 （2） 1，3丙二醇氧化还原酶的酶活力测定测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活。酶活测定根据250C条件下NAD+还原成NADH的速率来定量。酶活单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物NAD+或生成1“raol产物NADH的酶量。第21页/共28页第二十一页，共29页。四、重组(zhn z)菌coliJMl09(pEt

15、acdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)发酵培养基优化第22页/共28页第二十二页，共29页。 菌株：重组菌Ecoli JMl09(pEtacdhaB-tac-yqhD，pUCtacdhaT)为本论文三中构建。 培养基和培养条件 LB培养基(L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠lO，琼脂15(固体培养基)，固体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至100tgmL、卡那霉素50pgmL。 种子培养基：采用(ciyng)LB培养基。 发酵培养基(gL)：甘油、酵母膏、KH2P04、MgS047H20和维生素B12 青霉素至100IxgmL、卡那霉素50rtgmL。材料(cilio)第23页

16、/共28页第二十三页，共29页。 摇瓶发酵：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入50 mL摇瓶(装液量为10mL)中，于旋转式摇床中37、150 rmin培养18 h得到种子液。接种于250 mL摇瓶中，在150 rmin旋转式摇床中，先于37。C培养至OD600为O7，再于37诱导发酵一定(ydng)时间。方法(fngf)第24页/共28页第二十四页，共29页。1、采用单因素实验分别(fnbi)考察了不同浓度的甘油、酵母膏、KH2P04、VBl2及M孑+等因素对重组菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)发酵结果的影响，确定了其发酵培养基的基本

17、组成为：甘油20gL、VBl2001gL、KH2P0475edL、M92+067gL和酵母膏5L，在此培养基中l，3一丙二醇的产量达到225L。 小结(xioji)第25页/共28页第二十五页，共29页。2、通过正交实验分析法进一步优化了重组(zhn z)菌EcoliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD，pUCtac-dhaT)的发酵培养基，其适宜组成为：甘油20 gL、VBl2 O01 gL、KH2P045 gL、M92+067 edL和酵母膏5L。最适发酵条件为：装液量10、接种量10、转速150rmin、接种后4d,时左右加入IPTG、IPTG终浓度为lmmolL。应用此培养

18、基l，3丙二醇的产量为24329L，第26页/共28页第二十六页，共29页。3、在通过正交实验优化后的培养基中，重组菌EcoliJMl09(pEtaedhaBtac-yqhD)与E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)经诱导前后1，3丙二醇的产量分别为03L、1943 gL及O3L、2432 gL。发酵24小时后，重组菌EcoliJM109(pEtacdhaBtac-yqhDDpUCtacdhaT)L,Ecoli JM109(pEtacdhaB-tac-yqhD)l，3丙二醇产量提高了251。可见(kjin)，由甘油到1，3-PD的反应，限速步骤是3羟基丙醛到1，3。丙二醇的反应。本研究成功构建了在大肠杆菌中利用了两种辅酶(NADH、NADPH)的共表达，减少3羟基丙醛的累积，提高了1，3-P