2生物大分子的制备ppt课件

1、2. 生物大分子的制备.2.1 概述 在自然科学，尤其是生命科学高度开展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的构造与功能的研讨是探求生命奥妙的中心课题，而生物大分子构造与功能的研讨，必需首先处理生物大分子的制备问题，有可以到达足够纯度的生物大分子的制备任务为前题，构造与功能的研讨就无从谈起。然而生物大分子的分别纯化与制备是一件非常细致而困难的任务。 . 与化学产品的分别制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： 生物资料的组成极其复杂，经常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物资料中的含量极微，分别纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦分开了生物体内的环境时就极易失活，因

2、此分别过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进展的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判别。 . 生物大分子的制备通常可按以下步骤进展： 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进展科研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 经过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物资料的破碎和预处置。 分别纯化方案的选择和探求，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性即纯度的鉴定，要求到达一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳

3、都是一个峰。 产物的浓缩，枯燥和保管。 . 分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法紫外可见、红外和荧光等分光光度法、电泳法、以及核磁共振等。实践操作中尽能够多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。. 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的才干、带电的

4、情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力。. 制备生物大分子的分别纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差别，如分子的大小、外形、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 各种方法的根本原理可以归纳为两个方面： 利用混合物中几个组分分配系数的差别，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； 将混合物置于某一物相大多数是液相中，经过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而到达分别的目的，如电泳、离心、超滤等。 目

5、前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。 .2.2 生物大分子制备的前处置2.2.1 生物资料的选择 制备生物大分子，首先要选择适当的生物资料。资料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 选择的资料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、本钱低，尽能够坚持新颖，尽快加工处置。 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，假设所要求的成分在细胞内，那么要先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物资料要及时将菌体与发酵液分开。 生物资料如暂不提取，应冰冻保管。动物资料那么需深度冷冻保管。 .2.2.2 细胞的破碎 不同的生物体或同终身物体的不同部位

6、的组织，其细胞破碎的难易不一，运用的方法也不一样，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较巩固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。(1)机械法：1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，参与少量石英砂研磨或匀浆。2) 组织捣碎器：这是一种较猛烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。. (2)物理法：1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内构成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高

7、而引起细胞溶胀破碎。2) 超声波处置法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。3) 压榨法：这是一种温暖的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高压下使细胞悬液经过一个小孔忽然释放至常压，细胞将彻底破碎。4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立刻放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。. (3)化学与生物化学方法：1) 自溶法：将新颖的生物资料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞构造在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。

8、2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在浸透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处置15分钟，可以专注性地将细胞壁分解。 4) 有机溶剂处置法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS十二烷基硫酸钠等外表活性剂处置细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法结合运用。 .2.2.3 生物大分子的提取 “提取是在分别纯化之前将经过预处置或破碎的细胞置于溶剂中，使被分别的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽能够坚持原来的天然形状不丧失生物活性的过程

9、。 影响提取的要素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相分散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。通常： 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度添加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的添加和坚持其生物活性。. 水溶液提取： 蛋白质和酶的提取普通以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应留意的几个主要影响要素是： 1) 盐浓度即离子强度：离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些

10、物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度添加。绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中参与少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大添加，称为“盐溶景象。盐溶景象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，添加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。为了提高提取效率，有时需求降低或提高溶剂的极性。向水溶液中参与蔗糖或甘油可使其极性降低，添加离子强度如参与KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4可以添加溶液的极性。 . 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量防止，普通控制在pH=68范围内，提取

11、溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时普通在05的低温操作。 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：参与抑制剂或调理提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。 . 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，普通采用温暖搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。由于普通蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基经常是活性部位的必需基团，假设提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的

12、二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中参与少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。. 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较结实或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取经常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。 例如，胰岛素见讲义p36。 .2.3 生物大分子的分别纯化 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物

13、分子又处于同一体系中，因此不能够有一个适宜于各类分子的固定的分别程序，但多数分别任务关键部分的根本手段是一样的。 为了防止盲目性，节省实验探求时间，要仔细参考和自创前人的阅历，少走弯路。常用的分别纯化方法和技术有： 沉淀法包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以引见沉淀法为主。.2.3.1 沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法即溶解度法操作简便，本钱低廉，不仅用于实验室中，也用于某些消费目的的制备过程，是分别纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。经过沉淀，将

14、目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分别。 其根本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而到达分别的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差别而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及构造有关，溶剂组分的改动或参与某些沉淀剂以及改动溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改动。 .在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分别纯化。 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分别纯化。 选择性沉淀热变性沉淀和酸碱变性沉淀：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的

15、杂蛋白。 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独运用较少，多与其他方法结合运用。 有机聚合物沉淀： 是开展较快的一种新方法， 主要运用PEG聚乙二醇Polyethyene glycol作为沉淀剂。.2.3.1.1 中性盐沉淀盐析法 在溶液中参与中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进展沉淀分别。 盐析法运用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： 本钱低，不需求特别昂贵的设备。 操作简单、平安。 对许多生物活性物质具有稳定作用。. 中性盐沉淀蛋白质的根本原理 蛋白质和酶均易溶于水，由于该分子的

16、COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用构成水化层，包围于蛋白质分子周围构成1nm100nm颗粒的亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子外表极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因此溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定要素有两个：即电荷和水膜。由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以参与大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴显露疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即构成沉淀。盐析表示图如下页“图 4所示。. 中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是NH42SO4，由于它与其他常用盐类相比有非常突出的优点：

17、 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因此盐析操作也要求在低温下04进展。由下表可以看到， 硫铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类： 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度克/100毫升水 0 20 80 100 NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 . 2) 分别效果好：有的提取液参与适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯 度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质构造的 作用。有的

18、酶或蛋白质用23mol/L浓度的 NH42SO4保管可达数年之久。 4) 价钱廉价，废液不污染环境。. 盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵参与法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地参与，接近方案饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量防止部分硫酸铵浓度过大而呵斥不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分别，高浓度硫酸铵常用过滤方法。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。. 盐析曲线的制造 假设要分别一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以自创，那么应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。详细操作方法如下(讲义p39)： 蛋

19、白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱 和度 . 盐析的影响要素1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，假设蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25 mg/mL30mg/mL。2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而添加的。普通

20、情况下，可在室温下进展。但对于某些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以防止活力丧失。 .2.3.1.2 有机溶剂沉淀法 根本原理 有机溶剂对于许多蛋白质酶、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早运用的沉淀方法之一。其原理主要是： 降低水溶液的介电常数，向溶液中参与有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而减弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 由于运用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因此发生沉淀作用。 .有机溶剂沉淀法的优点是： 分辨才干比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质

21、只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易如有必要，可用透析袋脱有机溶剂。因此在生化制备中有广泛的运用。其缺陷是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进展。 有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 为了获得沉淀而不着重于进展分别，可用溶液体积的倍数：如参与一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进展有机溶剂沉淀。. 有机溶剂沉淀的影响要素 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反响，因此必

22、需预冷，操作要在冰盐浴中进展，参与有机溶剂时必需缓慢且不断搅拌以免部分过浓。 普通规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低，要运用比例更大的有机溶剂进展沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。 通常运用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。 . 3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨才干。 4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超越5为宜，运用乙醇的量也以不超越原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白量变性有良好的维护作用，但盐浓度过高会添

23、加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。 沉淀所得的固体样品，假设不是立刻溶解进展下一步的分别，那么应尽能够抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如假设必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。.2.3.1.3 选择性变性沉淀法 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差别，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分别提纯。 热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保管目的物在溶液中。 外表活性剂和有机溶剂变性使那些对外表活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中

24、进展。 选择性酸碱变性 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分别纯化流程中附带进展的分别纯化步骤。.2.3.1.4 等电点沉淀法 利器具有不同等电点的两性电解质，在到达电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分别的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进展初步的沉淀分别。 由于许多蛋白质的等电点非常接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独运用此法分辨率较低，因此此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一同配合运用，以提高沉淀才干和分别效果。 此法主要用于在分别纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。.2.3.1

25、.5 有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代开展起来的一类重要的沉淀剂，最早运用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中运用最多的是 “聚乙二醇【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)】( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600020000的 PEG。 本方法的优点是：操作条件温暖，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，运用很少量的P“EG即可以沉淀相当多 的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。.2.3.2 透析 自T

26、homas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分别纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。 透析只需求运用公用的半透膜即可完成。保管在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保管液，袋膜外的溶液称为“渗出液或“透析液。截留分子量MwCO通常为1万左右。 用1 BaCl2检查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 检查NaCl、KCl等。.2.3.3 超滤 超越滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来开展迅速，很快由实验室规模的分别手段开展成重要的工业单元操作技术。超滤现已

27、成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子如蛋白质、酶、核酸等的浓缩、分别和纯化。超滤是一种加压膜分别技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。. 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反浸透三种。 微孔过滤所用的操作压通常小于4104Pa，膜的平均孔径为500埃14微米1微米104埃，用于分别较大的微粒、细菌和污染物等。 超滤所用操作压为4104Pa7105Pa，膜的平均孔径为10100埃，用于分别大分子溶质。 反浸透所用的操作压比超滤

28、更大，常到达35105Pa140105Pa，膜的平均孔径最小，普通为10埃以下，用于分别小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。. 超滤技术的优点是操作简便，本钱低廉，不需添加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温暖，与蒸发、冰冻枯燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因此可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。 在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。 超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，普通只能得到1050的浓度。. 超滤技术的关键是膜。 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来开展了非纤维型的各向异性膜，例

29、如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 114都是稳定的，且能在90下正常任务。超滤膜通常是比较稳定的，能延续用12年。 超滤膜的根本性能目的：水通量cm3/(cm2h)；截留率以百分率表示；化学物理稳定性包括机械强度等。 超滤安装由假设干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。 由于超滤法处置的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和堆积于膜外表上，呵斥严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要抑制浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。.2.3.4 冰冻枯燥 冰冻枯燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器

30、之一，由于大多数生物大分子分别纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的方法就是冰冻枯燥，由于生物大分子容易失活，通常不能运用加热蒸发浓缩的方法。 冰冻枯燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温暖高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻枯燥的原理可用溶剂的三相点相图来阐明，见图 6 ：. 当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂通常是水就可以由固相直接升华为汽相。冰：40 上方蒸汽压为0.1mmHg， 60 上方的蒸汽压为0.01mmHg。 1克0的冰变成0的蒸汽需吸热580千卡，容器外壁上会挂霜。突出的优点：样品不起泡，不暴沸。得到的干粉样品不粘壁，易取出。冰干后的

31、样品是疏松的粉末，易溶于水。. 样品溶液： 样品要溶于水，不含有机溶剂，否那么冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。 样品要予先脱盐，否那么冰冻后易融化。 样品缓冲液在冰冻时pH能够会有较大变化需参与pH稳定剂，如糖类和钙离子等。 样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。 . 装样品溶液的容器： 用各种尺寸的培育皿盛样品溶液，液层不要太厚，可以运用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超越2 cm。 冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和呵斥污染，因此要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否那么会影响冻干速

32、度。 溶液冰冻： 可用干冰乙醇低温浴速冻，边冻边旋转构成很薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。. 冻干： 样品全部冻干前，不要随便摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。 假设外霜消逝，那么阐明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延伸冻干时间即可。 冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。 仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。 样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。 真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，那么需换油。.2.3.5 样品的保管 生物大分子制废品的正确保管极为重要，一旦保管不当，辛辛劳苦制成的样品失活、变性、蜕变，使前

33、面的全部制备任务化为乌有，损失繁重，全功尽弃。 影响生物大分子样品保管的主要要素有： 空气：空气空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。 温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10，氧化反响约加快数倍，酶促反响添加13倍。 . 水份：样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参与水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。 光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保管，尤其日光中的紫外线能量大，影响最大，样品受光催化的反响有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保管。 样品的pH：保管液态样品时留意其稳定的pH范围，正确选择保管液态样品的缓冲剂的种类和浓度非常重要。 时间：生化和分子生物学样品不能够永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保管的样品必需写明日期，定期检查和处置。.现以保管蛋白质和酶为例： 低温下保管：通常要保管于520，70保管最理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90