川楝素的提取及其生物活性的测定(共7页)

1、川楝素的提取及其生物(shngw)活性的测定实习(shx)目的： 1）增强(zngqing)学生的动手实践能力，把课本所学的知识运用到生产实践当中，达到学以致用的目的。2）让学生真正了解天然产物的意义、内容、范围、特点及其应用的过程。3）培养学生的社会生产经验，为以后的社会生产打下基础。实习时间：2013年6月10日2013年6月12日生产实习基地西农大学生科创实验基地（西农生物质资源化学利用实习基地、陕西省资源化学与可持 续利用工程研究中心中试基地、西农爱康企业（杨凌）产品研发与检测实验室、西农陕西省科学院制药厂.植物提取车间）川楝素的发展背景川楠素是1955年四川中药研究所根据我国古代文献

2、记载、传统医学及民间流行使用情况, 在寻找代替进口药物山道年驱蛔药物时从几种楠属植物中发现的。在临床治疗的配合下, 四川省中药研究所第三研究室从1953年起, 开始探索川辣的驱蛔有效成份,1955年从韧皮部中分离出一种有效成份晶休, 定名为川楝素（Toosendonin）该品为白色针状晶体, 无色、无臭、味苦。易溶于乙醇甲醉乙酸乙脂丙一酮、二氧六环、吡啶等, 微溶于热水、氯仿、苯、乙醚，难溶于石油醚。熔点在含一分子结晶水时为178180 , 乙醉中结晶产物为238240 , 薄层上分单一的两个色点的熔点为243245 。四川省中药研究所顾月翠等用纸层分析光光度侧定法来定性定里分析川辣素。以乙二

3、醇作固定相, 苯一丙酮一乙二醇（9：1：饱和） 作移动相, 纸层析分离, 用对二甲氨基苯甲醛硫酸试剂显色。并发现川株素层析图谱始终存在有两个点而推测其有互变异构现象。钟炽昌等通过化学反应及光谱分析, 证明川株素为一吠喃三菇类化合物。初步确定了它的化学结构及立体构型（图1） 川楝素的研究(ynji)现状目前，提取川楝素的方法主要(zhyo)有：有机溶剂浸取法、连续溶剂萃取法等。前一方法中直接用有机溶剂浸渍川楝韧皮粉，提取时间长；后一方法采用80的水首先浸提川楝韧皮粉，再用氯仿萃取水提取浓缩液中的川楝素，该方法以水为溶剂(rngj)，大大降低了提取成本，川楝素的提取率为0.25-0.3%，但存在浸

4、取时间长，能耗大等缺点。随着川楝素的广泛应用，其需求量也越来越大，因此找到一种新的川楝素提取方法也越来越迫切。超声波是频率高于20HZ，并且不引起听觉的弹性波。现普遍认为其空化效应、热效应和机械作用是超声技术在植物有效成分提取中的三大理论依据。超声作用可以使常温常压不能发生的化学反应在空化作用下发生，甚至使非常坚硬的固体被粉碎。控制一定的超声频率和强度，空化作用产生的极大压力造成生物细胞壁及整个生物体破裂，而且整个破碎过程在瞬间完成，同时超声波产生的振动作用加强了细胞内物质的释放、扩散及溶解。被浸取的物质在被破碎瞬间生物活性保持不变，同时提高破碎速度和提取率。超声波协助提取方法具有方便、快速、

5、简单、安全等优点，人们广泛利用超声波技术提取环境中的重金属、植物样品中的重金属及有效成分。 六、实习内容设备结构图具体实习(shx)内容2.1 材料(cilio)与试剂20kg川楝子，80%的工业(gngy)乙醇，乙酸乙酯，石油醚，NaCl，Na2SO4，氯仿，甲醇，28人工海水孵化28h的卤虫1525头。2.2 主要仪器中草药热回流提取机组（陕西省三原昌泰有限责任公司）、R1002B 旋转蒸发器（规格 10L，上海申生科技有限公司）、RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣升化仪器厂）、SHB-3 循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）、FA2004 电子天平（上海舜字恒平科学仪器有限公司 senc

6、o）、DG/20-002A 台式干燥箱（中华人民共和国重庆试验设备厂）、XSZ-4G 生物显微镜（重庆COIC）、移液枪。2.3 实验步骤2.1.1 提取工艺流程介绍在进行提取之前，负责车间人首先先带我们熟悉了一下车间的整体情况以及实验操作要点。给我们详细的讲述了整个车间的操作流程，包括机械控制、进出料、冷却水走向以及料液走向等。在参观的过程中，我们看见了一套完完整整的管路系统。在整个系统中，冷却水始终是下进上出，用来加热的油也是下进上出。各种管道相互交错组成了一个非常复杂的管路。提取的装置是一个很大的提取罐，工业上用的是6t的椭圆形提取罐，但本次试验采用的是500L的一般的提取罐，提取罐上面

7、有三个进口，分别为物料进口、溶剂进口和回流口。注意在操作过程中不要触碰到运输油的管道。2.1.2 提取首先将20kg的川楝子、80%的乙醇溶液按1：10的比例加入到提取罐中。由于时间原因，略去了3h的浸泡阶段(jidun)，直接开始加热提取，加热是通过320#的油加热夹层中的蒸汽实现的，68开始回流。每次提取(tq)维持两个小时，共提取了两次。2.1.3 浓缩(nn su)正规的浓缩应该是在浓缩罐里进行的，但由于此次的料液量比较少，故分批在一个较大的旋转蒸发仪上对粗提液进行浓缩，冷却液用的是乙醇，其效果比水冷却好。浓缩进行了两天。故我们的萃取实验用的是前面班级的提液。2.1.4 萃取石油醚萃取

8、：用200mL石油醚对浓缩液进行萃取，萃取两次。分液漏斗中上层为石油醚相，金黄色油层，下层水相为红棕色溶液。乙酸乙酯萃取：用200mL工业乙酸乙酯对经石油醚萃取之后的水相进行萃取，萃取三次，分液漏斗中上层为乙酸乙酯相，橙黄色油层，中层为乳状液（分液漏斗摇晃过于激烈的缘故），下层为水相，红棕色溶液。每次得到的乙酸乙酯相饱和NaCl溶液洗涤，除去乙酸乙酯剩余的水分。分别对最终的石油醚相、乙酸乙酯相、水相用旋转蒸发仪进行旋蒸除去石油醚、乙酸乙酯、水相至膏状。石油醚相和乙酸乙酯相旋蒸后剩余的物质放在蒸发皿中自然晾干，水相旋蒸后剩余的放在干燥箱中烘干。2.1.5 生物活性测定称取3.6g石油醚、3.4g

9、乙酸乙酯、2.6g水相中的物质与PCR管中，经过处理后，分别用DMSO进行溶解，配制成200mg/mL的溶液。由于水相中物质的溶解度比较小，所以需用超声波清洗仪进行处理，促进其溶解。准备三个96孔板，分别标明：石油醚相、乙酸乙酯相和水相。在标有石油醚相的孔板上取前三列为阳性对照（纯的川楝素对卤虫的致死实验，也分为100ppm，50ppm，10ppm）。接下来每三列为一个小组，共三组。每个孔板上的每一个小组中第一列为100ppm的混合液，第二列为50ppm的混合液，第三列为10ppm的混合液，100ppm：10L配好的溶液+190L卤虫液；50ppm：5L配好的溶液+195L卤虫液；10ppm：

10、1L配好的溶液+199L卤虫液）。在石油醚相板中设了四组对照，第一组为10L DMSO+190L卤虫液；第二组为5L DMSO+195L卤虫液；第三组为1L DMSO+199L卤虫液；第四组为200L卤虫液。在96孔板上面加液时，全部用移液枪进行。 孔板上面的混合液和卤虫配完后，在室温下放置24个小时，然后分别将三个孔板放入显微镜下面数死去海虾的数量，再将孔板至于60左右的干燥箱中进行高温处理后，数出海虾的总数，得到的数据如下表1-4所示。并且对三相用15:1的氯仿-甲醇展开剂进行TCL色谱分析，结果如图3，纯的川楝素中出现两个斑点。石油醚相比乙酸乙酯相展开得快，水相基本上没怎么展开。 图 3

11、 TLC 色谱分析(s p fn x)图表 1 石油醚相板石油醚相板阳性对照第二组100ppm50ppm10ppm100ppm50ppm10ppm123789A9/94.5/56/813/175.5/72/8B7/73/32/29/177.5/93.5/5C8.5/96/74.5/910/1410/183/8D2/23/34.5/52.5/76.5/123/10E3/33/30/019/2110/144.5/17F11/113.5/47/711/144/85/9平均死亡率%99.07 93.87 83.00 67.60 65.51 40.75 表 2 乙酸乙酯相板 乙酸乙酯相板第二组100pp

12、m50ppm10ppm789A8/102/28/8B13/133/33/3C11/116/610.5/11D9/912/157/9E11/123/310/10F13/133/43/3平均死亡率 % 95.28 92.50 95.54 表3 水相板水相板第二组100ppm50ppm10ppm789A2.5/50/40/7B1/170/50/16C0/140.5/91.5/5D0/70/51/8E1/31/110.5/22F2/170/21/20平均死亡率 % 16.83 2.44 8.30 表4 对照(duzho)试验对照组100ppm50ppm10ppm卤虫液平行实验0.17 0.25 0.0

13、7 0.00 0.10 0.25 0.13 0.05 0.25 0.10 0.20 0.05 平均死亡率17.22 20.00 13.49 3.03 计算公式：活性用校正(jiozhng)死亡率表示： 校正(jiozhng)死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/(1-对照组死亡率)100% 表5 校正死亡率校正死亡率阳性对照不同浓度处理（第三组）/ppm10050101005010石油醚相% 99.0793.87 83.0060.8656.8931.51乙酸乙酯相%94.3090.2394.84水相%-0.47-21.95-6.00实验结果与误差分析实验结果由实验(shyn)数据及计算结果可

14、知，对海虾的致死率由高到低依次(yc)为，乙酸乙酯相、石油醚相、水相。并且(bngqi)会随着浓度的增大致死率增大。说明川楝素主要存在乙酸乙酯相中。水相的校正死亡率均为负值，原因可能为：水相中含有促进海虾生长的物质。误差分析1.当浓度为100ppm和50ppm时，与阳性对照组的致死率很接近，但浓度为10ppm时，与阳性对照组相差很大。可能是因为浓度太小，移取液体时，给实验带来了误差。2.川楝素的不完全浸取，提取液转移过程中存在损失，干燥过程中川楝素的部分失活；3.旋蒸移液过程、萃取过程中，部分溶液损失，造成实验误差；4.海虾的吸取不具有代表性、每个孔板内海虾数量不定、显微镜下观察时间过长，温度过高导致海虾的死亡；5.配置的溶液浓度有点大，海虾少，造成海虾致死率高等均对实验结果造成了一定的不准确性。6.在数海虾数量时，由于每个人数的标准都不一样，所以造成实验结果产生误差。4.实验总结与体会 本次天产加工实习我们完成了对川楝素的提取及生物活性测定，对与实验流程有了熟悉的了解。并且通过三天的熟悉观察完成了设备结构图，很有成就感。第一次做生物活性测定实验，