地质微生物学：第二章 地质微生物学研究方法

1、第二章 地质微生物学研究方法第一节 纯培养与显微技术第二节 地球微生物非分子学方法第三节 地球微生物分子学方法一 微生物的分离和纯培养 1.无菌技术 2.用固体培养基分离纯培养 3.用液体培养基分离纯培养 4.单细胞（孢子）分离 5.选择培养分离 6.微生物的保藏技术 7.菌种的衰退与复壮二 显微镜和显微技术 1.显微镜的种类及原理 2.显微观察样品的制备第一节 纯培养与显微技术微生物个体：小利用群体研究属性群体形式繁衍、保存人为规定的条件下培养繁殖得到的 微生物群体为培养物（culture）怎样研究？培养物纯培养物混合培养物纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一只有一种微

2、生物的培养物称为纯培养物（pure culture）显微技术是微生物研究的另一项重要技术微生物个体小怎样观察？一、微生物的分离和纯培养1、无菌技术（aseptic technique) 分离、转接、培养时防止其他微生物污染的技术试管、烧瓶、培养皿（Petri dish）等常用器皿 灭菌方法有：高压蒸汽灭菌、高温干热、煮沸1）、微生物培养常用器皿及灭菌 接种针或接种环分离或将微生物从一个培养器皿转 接到另一个，无菌操作。火焰旁边或无菌箱或无菌室 进行。 接种针采用迅速加热和冷却的镍铬合金制备 液体培养物用无菌移液管或移液枪2）、接种操作，最基本技术无菌操作台厌氧培养箱火焰旁无菌区3）、微生物的培

3、养方法根据氧气的需要与否分为两大类： 好氧培养 厌氧培养 根据培养基的物理特性分为两大类： 固体培养 液体培养 好氧培养厌氧培养固体（好氧）培养液体（好氧）培养2、用固体培养基分离纯培养 各种菌落菌落(colony)：单个微生物在固体 培养基或内层）生长繁殖形成肉眼 可见的，有一定形态结构的子细胞 生长群体。 众多菌落连成片为菌苔（lawn）各种微生物形成的菌落特征 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），是微生物分类、鉴定的重要依据。 同一细菌在不同的培养基上形成不同的特征菌落 培养平板（culture plate）是被用于获得微生物纯培养的最常用的

4、固体培养基形式平板（plate）即培养平板（culture plate)。融化的固体培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，用于分离、培养微生物。 1）、稀释倒平板法 pour plate method 常用固体分离纯培养方法： 2）、涂布平板法 spread plate method 3）、平板划线分离法 streak plate method 4）、稀释摇管法 dilution shake culture method 1）、稀释倒平板法（pour plate method) 2）、涂布平板法(spread plate method) 稀释平板法因为细菌与50培养基混合导致某些热敏感菌死亡，

5、及好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长，所以更常用涂布平板法。3）、平板划线分离法（streak plate method） 接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。 平行划线后细菌生长情况平皿划线分离法A.扇形划线; B.连续划线; C.方格划线4）、稀释摇管法(dilution shake culture method） 稀释滚管法(dilution roll tube method）厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。 操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50， 待分离材料用这些试管梯度稀释 ，摇匀，冷凝，石蜡封口 厌氧微生物分离装置：厌氧罐厌氧手

6、套箱 有些微生物需液体培养基分离纯培养，原生动物、藻类。通常采用稀释法。3、液体培养基分离纯培养 接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（95）没有，那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。稀释法缺点分离的优势菌4、单细胞（单孢子）显微分离显微操作（毛细吸管、液滴），专业程度高显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养5、选择培养 对某微生物生长需要了解后，设计适合其生长繁殖的培养基，抑制其他菌生长，即使该微生物在混杂群体中很少也可分离。 选择培养的方法：1）、选择平板培养2）、富集培养1）、选择平板培养 如：耐高温菌采用高

7、温筛选；蛋白酶产生菌加牛奶筛选； 抗抗生素可采用加抗生素筛选 待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加从自然界中分离到所需的特定微生物2）、富集培养 微生物菌种保藏技术：为何保藏？如何保藏？性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则 生产或科研都无法正常进行。 要求：菌种不死，不污染，不变异6、微生物的保藏如何保藏？根据菌种特性和保藏目的不同， 给特定环境使其存活而得以延续连续移种或改变环境条件：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等保藏方法？1、传代培养保藏2、冷冻保藏3、干燥保藏 斜面：可保存数周至数年，可

8、用石蜡或橡皮塞 封口，低温延长保存时间。 液体：菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法） 缺点：繁琐、易污染、变异丧生原有特性。1）、传代培养保藏斜面、半固体琼脂柱、液体2）、冷冻保藏液氮保藏、低温冰箱等 液氮可达196，效果较好保护剂：甘油、血清、脱脂牛奶等注意：速冻，减少冰晶损伤细胞3）、干燥保藏沙土管保藏、冷冻真空干燥保藏沙土管：产孢子菌。制成孢子悬液，加无菌沙土管，减压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。 冷冻真空干燥：加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用不同手段保藏，防止某种方法失败导致菌种丧失。方法名称主要

9、措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法 冷冻干燥法低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养 干燥、无氧、低温、有保护剂各大类 细菌、酵母菌 各大类* 产孢子微生物 各大类36月 612月 12年 110年 515年以上简便 简便 简便 简便有效 简便有效菌种保藏方法比较 菌 连续在培养基上（内） 移种 种 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 生活态 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 休眠态 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上菌种保藏方法总结国内外菌种保藏机构中国微生物菌种保藏委员会(CCC

10、CM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 1）、衰退（degeneration） 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 7、菌种的衰退与复壮常见的衰退现象 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。防止菌种衰退的方法（1）控制传代次数 （2）选择合适的培养条件； （3）采用不宜衰退的细胞进行传代（4）采用有效的菌种保藏方法。2）、菌种的复壮（rejuvenatio

11、n）使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮：从衰退的群体中找出未衰退的体 广义的复壮：利用自发突变（正变）不断地从生产中选育优良菌种。菌种的复壮措施（1）纯种分离（2）通过寄主体内生长进行复壮（3）淘汰已衰退的个体二、显微镜和显微技术（一）、显微镜的种类及原理 1、普通显微镜 2、暗视野显微镜 3、相差显微镜 4、荧光显微镜 5、透射电子显微镜 6、扫描电子显微镜 7、扫描隧道显微镜（二）、显微观察样品的制备 1、光学显微镜的制样 2、电子显微镜的制样决定显微观察效果重要因素：分辨率和反差 分辨率：辨别两点之间最小距离的能力 反差：样品与背景区别程度 （一）、显微镜种类和原理：1、普通显微

12、镜 机械装置：镜座、支架、载物台、调焦螺旋 光学系统：物镜、目镜、聚光器 0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= n sin q 分辨率与所用波长成反比！分辨率与数值孔径值(n sin ) 0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= n sin q 浸没油与玻璃的折射率相近很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？目镜：10 15 ；物镜： 100 ；总放大倍数10001500 如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？ 使用

13、油镜，即在100 物镜和载玻片之间滴加香柏油； 香柏油与玻璃折射率相近2、暗视野显微镜 活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。无标本时，视野黑暗。有标本时，光线倾斜照在标本上，标本遇光发生反射和散射，散射的光进入物镜，物体明亮可见。 特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品与背景差别大，可以清楚看到透明微小颗粒。用于：生活细菌运动性观察。3、相差显微镜 光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以分辨。由于细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通

14、过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显微镜看到。 相差显微镜采用特殊光学装置：环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔物理奖。 相板上和环状光阑相对应的环状部分大多数是涂的吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来的光线，衍射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，光强度减弱，相位也适当改变。一般所用的相板推迟相位1/4，吸收80的直射光，这样，就使直射光和衍射光的强度接近，而相位差则增大或减少。由于透明标本内部构造的折射率不

15、同，产生衍射光的相位就会有不同程度的推迟，衍射光和直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。正相差-衍射光推迟1/4波长负相差-直射光推迟1/4波长4、荧光显微镜 荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在uv照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体，为荧光显微技术原理。在免疫学和分子生物学应用广泛。5、透射电子显微镜（简写TEM）用波长短的电磁波取代可见光，使分辨率提高。工作原理类似，因光源不同，有区别: 1）电子若遇空气中分子会发生偏转使物象不清楚，因此镜筒高真空 2)电子带电荷，电镜是用电磁圈使之聚焦 3)电子像人眼看不到，用荧光屏显示或感光胶片记录大肠杆菌 透射电子显微镜图电子显微

16、镜的分辨能力远高于光学显微镜6、扫描电子显微镜（SEM） 扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。 主要用于：样品表面结构7、扫描隧道显微镜（STM）80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。 其横向分辨率：0.10.2nm，纵向分辨率：0.001nm 这种分辨率足以对单个原子观察。 利用这种显微镜直接观察蛋白质、DNA、RNA等以及CM、virus等结构。扫描隧道显微镜下的DNA（二）、显微样品制备样品好坏直接

17、影响观察结果。 考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法提高反差。显微样品制备之 光学显微镜制样光学显微镜制样活体观察染色压滴法悬滴法菌丝埋片法活菌死菌美蓝染色简单染色鉴别染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色 特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察 悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻片直接观察 菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬液，培养后，取下玻璃纸置于载玻片，观察 光学显微镜样品制备活体观察 活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。

18、染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附在玻片上；还可增加对染料的亲和力。 常用：酒精火焰加热和化学固定两种方法 光学显微样品制备染色观察大肠杆菌革兰氏染色 枯草杆菌革兰氏染色电镜制样显微样品制备之 样品观察前要固定和干燥，一般要重金属盐染色或喷镀，提高反差，使电子图像清晰。透射电镜制样 覆盖有支持网的载网（一般为铜网、不锈钢、金、银等） 负染技术： 电子密度高、本身不显示结构、与样品几乎不反应的物质，如：磷钨酸钠进行染色。 重金属盐不被样品吸附沉积在四周，若样品具有表面结构，重金属盐就进入表面凹陷部分，通过散射电子能力差异把样品外形和表面结构衬托出来。 负染技术简便易行，病毒、细菌鞭毛

19、、离体细胞器、蛋白质和核酸可用此方法观察。投影技术： 真空蒸发设备将铂或铬等对电子散射能力强的金属原子，由样品斜上方喷镀，提高样品反差。可用于病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸等观察。 超薄切片技术： 微生物个体虽小，微弱电子束无法透过整体标本，需制成100纳米以下的超薄切片才能看清内部细微结构。基本操作过程：取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、观察。 透射电镜制样 第二节 地球微生物非分子学方法一 具有地质作用的微生物的检测和分离 1.现场观察地球微生物事件 2.分子生物学技术检测二 样品 1.地面/地下样品 2.水样样品 3.样品中活性物质的分离和鉴定 原位地质微生物活性

20、研究 进行中的地质微生物活动的原位考察 自然界中的地质微生物学过程模拟 微生物转化反应产物的研究一 具有地质作用的微生物的检测和分离 1.现场观察地球微生物事件 为了检测地质微生物的活性,可视途径包括肉眼观察、光学显微镜观察、透射电镜观察。 藻类、地衣-直接观察；土壤、泥沙中-掩埋载玻片、毛细管，荧光显微镜；微生物化石-透射电镜和扫描电镜。 2.分子生物学技术检测 分子生物学技术发展迅速，可以定位和计量环境样品中的微生物，甚至包括虽然存活但在实验室没有纯培养的微生物。二 样品1.地面/地下样品 对于地下3000-4000或者更深的岩石样品，要通过特殊的钻取装置。2.水样样品 需要特殊装置。范多恩采水器，可以获得任何给定深度处的样品。尼斯金采水器。 水底的泥沙样品，采用挖泥机或取芯装置。 3. 样品储存 如不能立即检测，需要冷冻。 4.样品中活性物质的分离和鉴定 富集跟纯培养范多恩采水器，尼斯金采水器。、原位地质微生物活性研究 沉积层中远古时代地质微生物活动，；利用生物标志化合物推测以前发生过的地质微生物活动。叶绿素、脂类、胡萝卜素、甲基藿烷 同位素识别发生在地质史的过去的地质微生物活动。生物对