功效成分检测方法(共12页)

1、粗多糖(du tn)测定方法第一(dy)法本方法(fngf)参照保健食品功效成分检测方法（王光亚、白鸿主编）中“粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法”的方法测定。主要仪器离心机：4000r/min离心管：50ml分光光度计水浴锅漩涡混合器试剂实验用水为双蒸水，所用试剂为分析纯级。无水乙醇80%（V/V）乙醇溶液葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的分析葡萄糖0.5000g加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（0.1mg/ml）。5%苯酚溶液（W/V）：称取精制苯酚5.0g,加水溶解并稀释至100ml，混匀。溶液置于冰箱中可保存一个月。浓硫酸（比重1.84）

2、。0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5）：31.5ml（0.2mol/L）磷酸氢二钠与68.5ml（0.2mol/L）磷酸二氢钠混合。测定步骤样品提取：称取混合均匀的固体样品1.02.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加热1小时，冷却至室温后补加水至刻度（V1）。取50ml上述提取液置于100ml具塞锥形瓶中，加1ml 10%淀粉酶液和0.5ml 0.2M磷酸盐缓冲液，加塞，置5560酶解1小时，再加约为样品体积1%的葡萄糖苷酶于60以下再水解1小时候取出（用碘液检验是否水解完全，如不完全可延长水解时间至酶解液加碘液不变蓝色为止），于电炉上小心加热至沸腾做灭酶处理，

3、冷却至室温，定容至100ml，过滤，取滤液沉淀粗多糖。沉淀粗多糖：准确吸取上述滤液5.0ml（V2），置于50ml离心管中，加入无水乙醇20ml，混匀，与4冰箱静置4小时以上，以4000r/min 离心5min，弃去上清液，残渣用80%（V/V）乙醇数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至1025ml（V3）（根据糖浓度而定），供测定用。标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml（相当于葡萄糖0mg、0.01mg、0.02mg、0.04mg、0，06mg、0.08mg、0.10mg）置于25ml比

4、色管中，补加水至2.0ml，加入5%苯酚溶液1.0ml，在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，在旋涡混合器上小心混匀，置沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。样品测定：准确(zhnqu)吸取样品测定液适量（V4）（含糖0.020.08mg）置于25ml比色管中，补加水至2.0ml，然后按（3）法测定吸光度(gungd)值。从标准曲线上查出葡萄糖含量，计算样品中粗多糖含量。结果(ji gu)计算 m1V1V3 X=0.9100 m2V2V4式中X样品中粗多糖含量mg/10

5、0g(ml)；m1样品测定液中葡萄糖的质量（mg）；m2样品质量（g或ml）；V1样品提取液总体积（ml）；V2沉淀粗多糖所用样品提取液体积（ml）；V3粗多糖溶液体积（ml）；V4测定用样品液体积（ml）；0.9葡萄糖换算为粗多糖的系数。第二法按保健食品功效成分检测方法（王光亚、白鸿主编）中“葡聚糖的分光光度测定法”的方法测定。本方法适用于各类食品中以葡聚糖为主要结构，相对分子质量10000以上的水溶性粗多糖的测定。本法最低检出限为5.0mg/L。方法提要食品中相对分子质量大于1104的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉

6、淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖的含量。主要仪器1）分光光度计2）离心机（3000r/min）3）旋涡混合器试剂本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。乙醇溶液（80%）：200ml水中加入无水乙醇80ml，混匀。氢氧化钠溶液（100g/L）：称取100g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。加入固体无水 硫酸钠至饱和，备用。铜试剂储备液：称取3.0g五水硫酸铜，30.0g枸橼酸钠，加水溶解并稀释至1L，混匀，备用。铜试剂溶液：取铜试剂储备液50ml，加水50ml，混匀

7、后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。洗涤剂：取水50ml，加入10ml铜试剂溶液、50ml氢氧化钠溶液，混匀。硫酸溶液（10%）：取100ml浓硫酸加入(jir)到800ml左右水中，混匀，冷却后稀释至1L。苯酚溶液（50g/L）：称取精制苯酚5.0g，加水溶解(rngji)并稀释至100ml，混匀。溶液置冰箱中可保存一个月。葡聚糖标准储备(chbi)液：准确称取相对分子质量5105已干燥至恒重的葡聚糖标准品0.5000g，加水溶解，并定容至50ml，混匀，置冰箱中保存。此溶液1ml含10.0mg葡聚糖。葡聚糖标准使用液：吸取葡聚糖标准储备液1.0ml，置于100ml容量瓶中，

8、加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。此溶液1ml含葡聚糖0.10mg。测定步骤8.1样品处理8.1.1样品提取：称取混合均匀的固体样品2.0g,置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴上加热2小时、冷却至室温后补加水至刻度，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖。8.1.2沉淀粗多糖：准确吸取样品提取中终滤液5.0ml或液体样品5.0ml，置于50ml离心管中，加入无水乙醇20ml，混匀5min后，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用80%(体积分数）乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3-4次。残渣用水溶解并定容至5.0ml，混匀后供沉淀葡聚糖。8.1.

9、3沉淀葡聚糖：准确吸取沉淀粗多糖后的终溶液2ml，置于20ml离心管中，加入100g/l氢氧化钠溶液2.0ml、铜试剂溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min,弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10%（体积分数）硫酸溶液2.0ml溶解并转移至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。8.2标准曲线的绘制：准确吸取葡聚糖标准使用液0ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml（相当于葡聚糖0mg、0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08m

10、g、0.10mg），分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入50g/L苯酚溶液1.0ml，在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸10.0ml，于旋涡混合器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 8.3样品测定：准确吸取样品测定液2.0mL，置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL,在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL,在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm

11、比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖含量，计算样品中粗多糖含量。同时做样品空白试验。结果计算 (m1-m2)V1V3V5 X= m3V2V4V6式中 X样品中粗多糖含量（以葡聚糖计）（mg/g） m1样品测定液中葡聚糖的质量（mg） m2样品空白液中葡聚糖的质量（mg） m3样品质量（g） V1样品提取液总体积（ml） V2沉淀粗多糖所用样品提取液体积（ml） V3粗多糖(du tn)溶液体积（ml） V4沉淀葡聚糖所以粗多糖溶液(rngy)体积（ml） V5样品测定(cdng)液总体积（ml） V6测定用样品测定溶液体积（ml）准确度与精密度在不同食品中进行不同浓度的加标回收实验，回收

12、率为87.8%110.87%，不同实验室对同一样品进行10次测定结果的相对标准偏差为5.8%。注意事项 本方法测定的水溶性多糖含有10个以上单糖残基。 在测定过程中应避免糖和其他碳水化合物的污染，因为苯酚硫酸与糖和碳水化合物起反应。 某些保健食品中功效成分为醇溶性多糖，可参照本方法进行测定，但样品预处理时将乙醇改为丙酮即可。 洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其他糖分和碳水化合物用80%乙醇洗净，否则结果偏高。 此法适用于测定高分子量的糖类物质（10000Da）。低聚木糖的测定1.试剂（1）4mol/L硫酸：98%硫酸用水稀释而成，并标定校准浓度；（2）40%氢氧化钠：取40.0g氢氧

13、化钠，加入100ml水溶解即可；无水乙醇（AR）；乙腈（色普级）；0.45m水相过滤膜。仪器及色谱条件仪器高压液相系统（515高压泵、7725进样阀、柱温箱、2414示差折光检测器、色谱工作站），真空泵或电吹风。色谱条件色谱柱：Waters Carbohydrate High Performance 4m 4.6250mm Cartridge流动相：乙腈：水=75：25（V/V）；流速：1.0ml/min；柱温：35；示差检测器温度：35。进样量：20.0l样品处理取约1.0g样品于50.0ml小烧杯中，加10.0ml水溶解样品，并转入50.0ml容量瓶中，再加水5.0ml洗涤烧杯并全部转入容

14、量瓶中，最后用无水乙醇定容至刻度，摇匀离心（4000r/min，10min），取上清液15.0ml于小烧杯中用电吹风（不大于50）吹赶尽乙醇，用水溶解定容至15.0ml。（该溶液为样品水解前上机测定溶液M1）取10.0ml于水解管中，加入4mol/L硫酸1.80ml，摇匀，于100水解2小时，冷却；用40%氢氧化钠中和（pH值5-7），加水定容至25.0ml的容量瓶中，摇匀，取上清液2.0ml，用无水乙醇定容至10.0ml刻度摇匀离心，取上清液8.0ml于小烧杯中，电吹风吹干；加水溶解，定容2.0ml，用0.45m水相膜过滤。（该溶液为样品水解后上机测定溶液M2）。上机测定(cdng)样品(y

15、ngpn)的体积：V1（ml）=50ml V2（ml）=156.25ml计算(j sun)标准样品：取纯度为99.5%木糖75.0mg于25.0ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成3.0mg/ml木糖标准品溶液，备用。低聚木糖含量X（%，以木糖计）=M2-M1M1：样品水解前低聚木糖含量（%）；=Aspl/AstdCstdV110-3/W100M2：样品水解后低聚木糖含量（%）；=Aspl/AstdCstdV210-3/W100 Aspl：样品中木糖组分峰面积； Astd：标样木糖组分峰面积； Cstd：标样木糖组分浓度（mg/ml）； V1：水解前稀释体积（ml）； V2：水解后稀释体积

16、（ml）； W：样品重量（g）计算结果保留两位有效数字淫羊藿苷的测定范围本方法规定了保健食品中淫羊藿苷的测定方法。本方法适用于以淫羊藿为原料的保健食品中淫羊藿苷的测定。本方法的检出限：0.1mg/kg本方法的线性范围：20100g/ml原理样品经70%乙醇在超声波振荡下提取，定容，离心后取上清液过滤膜，经C18反相柱分离，在紫外检测器270nm波长处检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。试剂无水乙醇（AR）甲醇（优级纯）石油醚（AR）水（实验室一级用水）聚酰胺粉（60目-80目）淫羊藿苷标准品（纯度98.0%）淫羊藿苷标准溶液：精密称取淫羊藿苷标准品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的

17、溶液。仪器设备高效液相色谱仪：附紫外检测器（UV）超声波清洗器离心机层析柱（内径1.5cm，长15cm）分析(fnx)步骤样品(yngpn)处理取本品10片，除去包衣，研细，精确称取适量（约相当于4片），置于100ml锥形瓶中，加70%乙醇30ml，超声提取(tq)20min，过滤。用少量70%乙醇洗涤残渣，收集滤液，并定容至50ml，混匀，经0.45m微孔滤膜过滤后进样。标准曲线的绘制将淫羊藿苷对照品使用液用甲醇稀释为2.0g/ml、5.0g/ml、25.0g/ml、75.0g/ml、125.0g/ml的标准溶液系列。液相色谱参考条件色谱柱：C18柱 4.6mm250mm，5m柱温：室温紫外

18、检测器：检测波长270nm流动相：甲醇+水=65+35流速：1.0ml/min进样量：10l色谱分析：取标准溶液系列及试样溶液注入色谱柱中，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。分析结果表示计算： CVF X= m1000式中：X试样中淫羊藿苷的含量，g/L； C由标准曲线求得进样液中淫羊藿苷的浓度，g/ml； V试样定容体积，ml； F试样稀释倍数； m试样体积，ml；本方法参照GB/T22247-2008保健食品中淫羊藿苷的测定方法制定保健食品中肉碱的测定1范围本方法规定了片剂、胶囊保健食品中肉碱的测定方法。本方法适用于以肉碱为主要原料的片剂、胶囊中肉碱的测定。本方法最低检出量为0.

19、27ug。本方法最佳线性范围：0.050mg/mL2.0mg/mL。原理 试样中的肉碱以0.5mmol/L的盐酸超声提取，反相色谱分离，与标准品的保留时间比较定性，以峰面积外标法定量。试剂除特殊说明，所用试剂均为分析纯。实验用水为去离子水或同等纯度的蒸馏水。31 磷酸氢二钾32 辛烷磺酸钠33 0.50mmol/L盐酸34 肉碱标准溶液：精密称取干燥(gnzo)至恒重的肉碱标准品(含量(hnling)98%)0.0200g，用0.50mmol/L盐酸(yn sun)溶解并定容为10.0mL，此溶液浓度为2.0mg/mL。仪器41 HPLC系统，配有紫外检测器和色谱工作站；42 超声波提取器；4

20、3 溶剂微孔过滤器带0.45um水相滤膜。分析步骤51 试样预处理：准确称取粉碎并混合均匀的式样0.50g（含肉碱约40毫克）；液体试样取5.0mL，于50mL容量瓶中，加入0.50mmol/L盐酸约35mL，超声提取10min，用0.50mmol/L盐酸定容，混匀，过滤，弃初滤液数毫升，收集滤液，过0.45um水相滤膜，为试样处理液。供HPLC分析。52 试样分析521 色谱条件：ShimpakCLC ODS 柱；4.6200mm,10um；522 流动相：0.05mol/L(3.4g) 磷酸氢二钾溶液，0.002mol/L辛烷磺酸钠; 10%乙腈；PH2.5。523 流速：0.8mL/mi

21、n；524 检测器：紫外检测器；检测波长： 210nm；53 标准曲线：分别取标准溶液0.0,0.25,0.50,1.0,2.0,2.5,5.0mL标准溶液（3.4）于5mL比色管中；用0.50mmol/L盐酸稀释并定容为5.0mL，分别进样20uL进行色谱分析。用标准浓度峰面积绘制标准曲线。54 试样测定：取20uL试样处理液（5.1）注入色谱仪中，以保留时间定性，面积定量。5 色谱图 5. 6分析结果表述试样中肉碱的含量按5.5.1式计算561 计算 CV X= m式中： X 为试样中肉碱的含量，mg/g；m为试样质量，g；C为试样处理液中肉碱的浓度，mg/mL； V为试样处理液体积，mL

22、。5.6.2 结果(ji gu)表示结果(ji gu)保留三位有效数字。 6 . 技术参数重复(chngf)测定值的RSD小于6.0%。回收率：90.3101.1%保健食品中人参皂甙高效液相色谱测定适用范围本方法规定了人参含片、人参冲剂、人参茶、人参胶囊等以人参为主要原料的保健食品中人参皂甙的含量的HPLC的测定方法。本方法适用于人参含片、人参冲剂、人参茶、人参胶囊等以人参为主要原料的保健食品中人参皂甙的含量的HPLC的测定方法。本方法的六种皂甙的最低检出量为 10 mg/kg。本方法的六种皂甙的最佳线性范围：0.1mg/mL1mg/mL。原理将试样中的人参皂甙溶解、提取，经净化处理后，使用梯

23、度洗脱反相高效液相色谱进行分离，紫外检测器（UV）检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，适用于保健食品中人参皂甙Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rd的同时定量分析。3. 试剂实验用水为去离子水。3.1 乙腈：色谱纯，200nm吸光度值为0.021。3.2 甲醇：分析纯。3.3 101大孔吸附树脂。3.4 高效液相色谱流动相：梯度淋洗A液为乙腈，B液为水。3.5人参皂甙Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rd标准品：含量大于98（HPLC）。3.6人参皂甙Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rd标准溶液的配制：配制人参皂甙Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rd标准储备液，浓度分别为1

24、0mg/mL；再以此储备液配制成混合标准系列溶液，浓度范围为0.1mg/mL1mg/mL；所有标准溶液均用甲醇配制。4. 仪器设备4.1 高效液相色谱仪：双高压输液泵，附紫外检测器。4.2 超声波清洗器。4.3 离心机。4.4 水浴锅。5. 分析步骤5.1 固体试样处理：取片剂或胶囊内容物研成粉末，并过20目筛；精确称取该粉末样适量于50mL具塞试管中，加水50ml于超声波清洗器中超声提取30分钟，取出，待溶液恢复常温后，准确取出10ml，通过D101大孔吸附树脂净化柱（大孔吸附树脂使用前先经甲醇浸泡，水洗，装成10cm长小柱），小柱先用10ml水冲洗，弃去水液之后，用70%甲醇25 mL洗脱

25、皂甙，收集甲醇溶液，水浴上蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至5mL，该样液离心后过0.5m膜，滤液进行色谱分析。5.2 液体(yt)试样处理：含的液体试样：取一定量的试样于水浴上蒸干，残渣以50mL水超声提取(tq)30分钟，余下步骤与5.1相同。5.3 测定(cdng)：5.3.1 液相色谱参考条件5.3.1.1 色谱柱：反相C18柱, 4.6 x 250 mm，5m5.3.1.2 紫外检测器：检测波长 203nm5.3.1.3 梯度淋洗条件：时间（分钟乙腈（）水（）流速 (mL./min)梯度曲线016841.012018821.065540601.066540601.067510001.018

26、016841.015.3.1.4 柱温：35C5.3.2 色谱分析5.3.2.1 标准曲线的制备将混合标准系列溶液均取5L进HPLC分析，用峰面积对浓度作各皂甙的标准回归曲线。5.3.2.2 试样测定 取5L试样净化液进高效液相色谱分析，以绝对保留时间定性，用峰面积通过各皂甙的标准曲线定量计算试样中人参皂甙Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。 分析结果表述6.1 计算 C 5 5 100 试样中各人参皂甙的含量（g/100g） m 1000 式中：C 试样溶液中各人参皂甙的含量，mg/mL； m 试样质量，g；试样中总人参皂甙的含量（g/100g） CRe CRg1 CRb1 CR

27、c CRb2 CRd式中：CRe (g/100g)：试样中Re的含量CRg1 (g/100g)：试样中Rg1的含量CRb1 (g/100g)：试样中Rb1的含量CRc (g/100g)： 试样中Rc的含量CRb2 (g/100g)：试样中Rb2的含量CRd (g/100g)： 试样(sh yn)中Rd的含量6.2 结果表示： 计算结果保留(boli)三位有效数字色谱(s p)图保健食品中总黄酮的测定 试剂聚酰胺粉芦丁标准溶液： 称取5.0mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得50g/mL。乙醇 分析纯。甲醇 分析纯。分析步骤试样处理：称取一定量的试样，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL。此液于波长360nm测定吸收值。同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中的总黄酮含量。芦丁(l dn)标准曲线： 吸取(xq)芦丁标准溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，加甲醇至刻度(kd)，摇匀，于波长360nm比色。求回归方程，计算试样中总黄酮含量。计算和结果表示 式中： X：试样中总黄酮的含量，mg/100g； A：由标准曲线算得被测液中总黄酮