氧化型钙钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ

1、氧化型钙钙调素依赖性蛋白激酶uDOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.026 基金项目： 国家自然科学基金( 81372020) ; 湖北省卫生厅青 年科技人才项目( QJX2012-11 ); 武汉市首批中青年医学骨干人 才培养项目通信作者：吕菁君 ，Email ： lvjingjungmail钙/ 钙调素依赖性蛋白激酶家族(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK 包括CaMK, CaMK, CaMIffi, CaMBV。其中 CaMK在体内广泛分 布，在心肌细胞中高表达。钙/钙调素依赖性蛋白激酶

2、K (CaMK) 是多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为 Ca2+信号转导的关键 因子,调控细胞的多种生物学功能,包括氨基酸和脂质代谢,离 子通道 /受体及神经递质的合成与释放,维持细胞内钙稳态,调 控兴奋收缩耦联作用。近年来,蛋白质翻译后修饰与心血管疾病的发生发展机制之 间的内在联系受到关注。氧化型 Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶K 的发现将Ca2+与氧化应激紧密的联系在一起，NADPi氧化酶/CaMIK 信号通路在心肌梗死后心室重构、 病态窦房结综合征的 发病机制中起关键性致病作用。氧化型钙 /钙调素依赖性蛋白激 酶K的激活位点、激活通路以及下游效应产物成为新的关注点。CaMIK 蛋白翻译

3、后修饰钙/钙调素依赖性蛋白激酶H(Ca2+/calmoduli n-depe nde ntprotein kinase II, CaMH)在 20 年前被确定是由 Ca2+/ CaM 依赖激活的，其磷酸化位点是CaMI蛋白活性调节区域第 287苏氨酸( Thr287) 。研究表明，在没有 Ca2+ / CaM 参与下，血 管紧张素I诱导 CaMI蛋白活性调节区域第 281和第282双蛋 氨酸结构氧化，形成氧化型 CaMI( oxidized- CaMI)，导致 心肌细胞凋亡1-2。进一步的研究表明，CaMI第281 / 282 双蛋氨酸结构氧化激活(oxidized- CaMI)与CaMI第2

4、87苏 氨酸位点磷酸化激活(phos- CaMI)是完全独立的两个过程， 并不相互依赖(图 1 )。研究表明，CaMI的激活存在多种形式，不仅有Thr287磷酸化激活、第 281 和第 282 双蛋氨酸氧化激活，糖尿病，长期高 血糖导致CaMI蛋白活性调节区域第 280丝氨酸(Ser280)糖 基化;交感神经兴奋、神经内分泌过度不仅磷酸化激活第287苏氨酸(Thr287)，还导致第272半胱氨酸(Cys272)和第290半 胱氨酸( Cys290) 硝基化。CaMK I在心脏中的激活通路钙/钙调素依赖性蛋白激酶I在心脏中的激活通路主要通过 肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS和B -肾上腺素

5、能受体信 号通路(图2)。在心肌细胞中 RAAS系统通过AT1受体/NADPH 氧化酶信号通路氧化激活 CaMI，同时也能导致磷酸化激活 CaMI蛋白3-5。而B 1-肾上腺素能受体信号通路主要磷酸化激活 CaMKI 6 -8还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADP）H 氧化酶是体内 活性氧（ROS的最主要的来源之一。NADPK化酶的经典结构 由6个不同的亚单位组成，它们分别是位于细胞膜的核心亚基 gp91 phox和调节亚基p22phox,二者形成的膜复合体称为黄素 细胞色素b558，以及位于胞质中的水溶性调节亚基Rac、p67phox、p47phox、p40 phox 等。在 NADPi

6、氧化酶激活时，胞 质中的调节亚基转位与黄素细胞色素 b558 结合，含黄素的 gp91 phox催化亚基作为电子传递系统，以 NADPi为递氢体，催化反 应：NADPH+2WNADP+H+2O2超氧化物阴离子（02-）在超 氧化物歧化酶的作用下转化成 H2O2 02-和H2O2都是损伤细胞 最强的自由基。血管紧张素激动血管紧张素 1 受体（ AT1 受体）诱导 NADPH 氧化酶活化，细胞内大量的 H2O2直接作用于CaMI蛋白活性调 节区域第281/282双蛋氨酸结构，氧化激活 CaMI。激动AT1 受体同时也能导致 CaMI蛋白活性调节区域第 287苏氨酸磷酸 化激活。 Mark E An

7、derson 团队进一步研究证明，异丙肾上腺素 通过B 1-肾上腺素能受体信号通路，导致CaMI蛋白活性调节区域第 287苏氨酸磷酸化激活，并不作用于第 281/282 蛋氨酸 3-5 。蛋氨酸亚砜还原酶 A( methionine sulfoxide reductase A， MsrA）是目前发现的可在体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结 构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。 研究表明， 与超氧化物 歧化酶（SOD相比，MsrA不仅可以在细胞内发挥清除氧化因子 的作用， 还可以对已经发生的蛋白质氧化进行可逆性修复。 在心 肌细胞内，oxidized- CaMK第281 / 282 双蛋氨酸结构

8、氧化修 复是通过MsrA介导的。在MsrA作用下，心肌细胞内oxidized- CaMK氧化还原（图2）。过表达MsrA基因可以显著 减轻氧化应激引发的心肌细胞损伤和凋亡 9 。phos- CaMK和oxidized- CaMK在心血管病理生理中的 作用phos-CaMIC和oxidized- CaMK在心血管病理生理中各自发挥着重要作用，包括：窦房结细胞凋亡、心室肌细胞凋 亡、早期后除极、延迟后除极，参与慢性房颤，病态窦房结，心 肌梗死后心室重构， 心力衰竭，恶性室性心律失常的发生与发展。oxidized- CaMC与病态窦房结综合征 2005年，陈劲进等 10 研究发现慢性风湿性心脏病伴慢

9、性 房颤患者心房肌细胞内游离 Ca2+浓度显著高于窦性心律患者， 心房肌CaMC表达显著高于窦性心律组，提示慢性房颤患者心 房肌细胞内存在钙超载，Ca2+/CaMC信号转导途径可能是维持 慢性房颤的重要病理生理基础之一。2011 年，Mark E An derson 领导的团队在 J Clin In vest. 发表的研究11以及Heijmen等12的研究表明，NADPi氧化酶 关键亚基（P47phox）基因敲除小鼠能够减少血管紧张素C诱导的窦房结细胞凋亡、纤维化和功能障碍，提示NADP氧化酶介导 的CaMKI氧化在病态窦房结综合征发病机制中起着至关重要的 作用。在细胞实验中，他们应用特异性的

10、CaMI抑制剂KN-93,能够显著拮抗血管紧张素I对窦房结细胞的毒性作用。计算机模型实验显示，血管紧张素I诱导窦房结细胞死亡，在窦房结中形成电冲动缺陷， 并逐渐扩散， 产生窦房结自律细胞与周围心房细 胞不匹配，导致窦房结功能障碍。更重要的是，他们比较了心力 衰竭、病态窦房结综合征、 心力衰竭合并病态窦房结综合征三类 患者右心房中oxidized- CaMI的浓度，研究结果是心力衰竭合 并病态窦房结综合征的患者右心房中oxidized- CaMI的浓度显著高于心力衰竭患者， 但是与病态窦房结综合征患者比较差异无 统计学意义。这提示氧化型钙/钙调素依赖性蛋白激酶I是病态 窦房结综合征患者的生物学标

11、志物。oxidized- CaMI与慢性心力衰竭病理条件下，长时间激动B-肾上腺素能受体可以诱导心肌细胞肥大、凋亡、坏死，从而参与慢性心力衰竭的病理生理过程 13-14。B 1-肾上腺素受体诱导细胞肥大凋亡并不依赖于经典 的cAMP/ PKA途径，而是激活 Ca2+/CaMI信号途径15。过度 刺激成人心肌细胞 B 1-肾上腺素受体，可通过 CaMI诱导细胞 凋亡。CaMI主要通过核转录因子 k B诱导凋亡。在静息状态下 核转录因子k B被抑制性k B结合蛋白限制在胞浆内，CaMI磷 酸化后，诱导抑制性k B结合蛋白磷酸化，从而暴露出核转录因子K B的核定位序列使得核转录因子K B转移至胞核内

12、，影响转录，诱导细胞凋亡16。CaMKI B C转基因小鼠表现为心肌肥大 并伴有显著的室壁变薄以及细胞凋亡 17 。2011 年， Mark E Anderson 领导的团队在 Nature Medicine 杂志上发表相关研究表明18,醛固酮诱导NADPi氧化酶氧化激 活CaMI, oxidized- CaMI促进基质金属蛋白酶 9在心肌细胞 中过度表达，加剧心脏破裂，导致心肌梗死后小鼠病死率增加。 CaMI的心肌抑制剂，蛋氨酸亚砜还原酶 A或NADP氧化酶基因 缺陷可以防止醛固酮相关的心肌梗死后心脏破裂。Joiner等19和Luo等20进一步研究证实心肌细胞死亡 与线粒体内Ca2+超载，线

13、粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore ， mPTP） 开放及线粒体内膜电 位损耗（屮m有关。心肌缺血-再灌注，心肌梗死，神经源性 的损伤，激活CaMI，增加线粒体钙单向转换电流（I MCU）, mPTP过度开放，诱导心肌死亡。心肌缺血-再灌注损伤时，应用线粒体靶向性CaMI抑制蛋白或mPTP拮抗剂环抱菌素A,等效 地防止mPTR过度开放，线粒体内膜电位下降，减少线粒体破坏 和细胞程序性死亡。小鼠心肌和线粒体靶向性CaMI抑制剂减少I MCU,增加心肌缺血-再灌注损伤的耐受性，这表明 CaMI 介导的心肌病理性损伤与增加线粒体I

14、MCU密切相关。线粒体靶向性CaMI抑制剂可以减少心肌死亡和心力衰竭。oxidized- CaMI与恶性室性心律失常早期后除极(early after-depolarizations, EADs)和延迟后除极(delay after-depolarizations, DADs)是引起恶性室性心律失常和心脏性猝死的核心机制之一。过去 20 年，大多 数实验室的研究一致表明 Ca2+浓度增加，a、 B -肾上腺素能受 体激动，心率增快都能促使 CaMK 5全酶中相邻亚基彼此磷酸 化，激活CaMK 5。通过自体磷酸化作用，CaMKI可以感知细胞内Ca2+水平，调节细胞内Ca2+摄取与释放，钙瞬变的时

15、程幅 度和心肌兴奋收缩耦联。 CaMKI 和 Ica ， L 通道的 IQ 区结合， 使其磷酸化，致离子通道开放延长，增强 Ica ， L 的峰值和时程。 活化的CaMI 5通过磷酸化PLB,解除对钙泵SERCA2的抑制 作用，加强肌浆网对 Ca2+勺摄取能力，增加肌浆网钙容量。 CaMKI 5 过度激活引起 Ryanodine 受体功能异常，在细胞静息 状态下，Ca2+S过Ryanodine受体从肌浆网漏至胞浆内，舒张 期肌浆网的钙释放激活瞬时内向电流( Iti )引发延迟后除极。近年来研究结果证实在器质性心脏病中， 持续的氧化应激压 力通过NADP氧化酶依赖性ROS氧化激活CaMK影响IN

16、a失活， 扩大ICa, L,触发EADs和DADs导致器质性心脏病患者发生 致命性心律失常 21-25 。美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的 Xie 等26 采用膜片钳和钙内流成像负荷技术， 研究氧化应 激对家兔心室肌细胞动作电位的影响：由于H2O2氧化激活CaMKI，细胞内钙浓度显著增加，触发肌浆网在舒张期不恰当 地钙释放，激活瞬时内向电流(Iti )引发延迟后除极。H2O2(0.21.0 mmol/L )作用心室肌细胞 515 min，影响INa失 活，延长动作电位时程。INa通道阻滞剂河豚毒素(10卩mol/ L) 可以拮抗这一作用。H2O2增强ICa，L的峰值和延长动作电 位平台期，增加钙

17、内流， ICa， L 阻滞剂硝苯地平可以拮抗这一 作用。影响INa失活，扩大ICa，L，延长动作电位时程导致早 期后除极现象的发生(图 3)。CaMKI抑制剂KN-93 (1卩mol/ L )可以完全拮抗 H2O2诱 导EADs无活性的KN-93异构体KN-92无上述作用。选择性 CaMK 磷酸化抑制剂 AIP (autocamtide-2-relatedinhibitorypeptide ) 2卩mol/ L 也能显著抑制 H2O2诱导EADs发作。与 CaMI抑制剂KN-93比较，CaMI磷酸化抑制剂 AIP的抑制作用 更多地表现在影响INa失活，CaMI抑制剂KN-93对INa失活和 扩

18、大 ICa， L 都发挥作用。So ng Y-H研究证实CaMI在短暂的氧化压力下诱导大鼠心 肌细胞L-型钙电流(ICa , L)长时程易化(Iong-term facilitation , LTF) 21。1 mmol/L H2O2 作用大鼠心肌细 胞5 min, L-型钙电流长时程易化持续约1 h。CaMI抑制剂KN-93 能够完全逆转H2O2诱导的L-型钙电流长时程易化。进一步发 现，氧化激活CaMI和磷酸化激活 CaMI都参与维持 CaMI的 活化。但是肌浆网Ca2+释放和线粒体ROS生成在持续CaMI活化中起关键作用。长时程的心肌动 作电位重构是通过氧化 CaMI介导的。线粒体氧化激

19、活 CaMI 导致与心律失常相关的病理性心肌细胞记忆。oxidized- CaMK参与心肌缺血-再灌注损伤以及心肌 梗死后的炎症反应CaMKI在心肌中的促炎作用是一个新发现。CaMKI参与心肌缺血-再灌注损伤以及心肌梗死后的炎症反应。Ling 等27 首次研究证实在心肌细胞内 CaMI 5直接介导NF-k B激活， CaMK 5触发并维持缺血-再灌注损伤导致的炎症基因表达。 CaMI 5 基因缺失，减弱缺血 - 再灌注诱导的炎症反应。基因敲 除心脏特异性 CaMI 5 可以保护心脏，减少缺血 -再灌注损伤， 减少心肌细胞凋亡，减少梗死面积，改善心脏功能恢复。进一步 的研究表明，缺血-再灌注迅速

20、增加CaMI的活性，在再灌注数 分钟内活化NF-k B。活化的CaMI在心肌细胞中的表达直接导 致I k B激酶磷酸化，伴随核 P65的增加。在心肌梗死中，Toll样受体-4促进核因子k B依赖的炎症 反应和氧化损伤。MyD8( myeloid differentiation protein 88) 是 Toll 样受体的重要下游信号和功能蛋白。 2012 年， Singh 等 28研究发现脂多糖(LPS)激活Toll样受体-4 (TLR-4)诱导 心肌细胞CaMI氧化激活，补体因子B是oxidized- CaMI激活 后的下游效应蛋白。野生型小鼠心肌梗死后心脏中 oxidized- CaMI显著增加，但是 MyD88基因敲除(MyD88-/-)