1化学键合相色法课件

1、第九章1化学键合相色谱主要内容概述：特点 一固定相的制备和性能评价 二非极性键合相三新型高效化学键合固定相四一、概 述1、化学键合相色谱的定义2、化学键合相的特点3、化学键合相的稳定性3、化学键合相的分类1、化学键合相色谱的定义化学键合相色谱借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上形成化学键合相，以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱（bonded phase chromatography，BPC），简称键合相色谱。 2、化学键合相的特点与液液分配色谱相比，使用过程中固定相不流失，耐溶剂冲洗。与液固吸附色谱相比，消除了担体上的表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。表面

2、改性灵活，容易获得重复性产品。化学性能稳定，耐受范围为pH28。热稳定性好，一般在70以下稳定。载样量大，比硅胶约高一个数量级。梯度洗脱平衡快。3、化学键合相的稳定性1在较低pH值条件下（pH9） 键合相中SiOSi键很容易被KOH和NaOH这一类强碱性亲核试剂所切断： 4、化学键合相的分类 化学键合相的分类可以有不同的依据。按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；按键合有机硅烷的官能团：极性键合相、非极性键和相和离子交换键合相三种。二、固定相1、化学键合相的制备2、常见的官能团3、常用的键合相商品牌号4、化学键合相性能评价5、使用键合固定相应注意的问题1、化学键合相的制备要形成化学键合固定

3、相，有两个必要条件：所用的担体材料应有某种化学反应活性，如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化学反应的官能团，一般以硅胶最为理想的和常用。有机分子应含有能与担体表面发生反应的官能团。硅胶（SiO2xH2O）之所以是理想的化学键合相担体，主要由它的表面性质所决定。硅胶具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优点，另外，硅胶表面存在着足够的可反应硅羟基，因而是各种化学键合相理想基质材料。硅胶的性质1、化学键合相的制备硅胶预处理 溶剂与试剂预处理 衍生化反应 端基封尾 (1)硅胶的预处理在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸处理，洗去制备、运

4、输和保存过程中引入的污染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开，形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。(1)硅胶的预处理酸处理酸处理可以用0.1 mol/L的盐酸，于90下浸泡24 h，或以10%的盐酸在回流状态处理8 h 。中 和中和，水洗至无Cl- ，经酸处理后的硅胶表面的羟基浓度已达到理论值8 mol/m2左右。 干 燥在200以下真空烘干除去物理吸附水，注意不得超过200，否则硅醇基脱水形成硅氧烷结构。（2）溶剂与试剂预处理 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所使用的有机溶剂，必须进行干燥

5、。（3）衍生化反应 （1）SiOC键型（2）SiN或SiC键型 （3）SiOSiC键型 SiOC键型酯化反应是最早用于制备化学键合相的反应。这类固定相是直接用硅羟基SiOH与醇类ROH通过酯化反应制得。酯化反应在硅胶表面形成单分子层的硅酸酯。这类固定相虽然有很高的柱效，但是它显著的缺点是易水解、醇解，热稳定性差，在色谱发展早期用于正相色谱模式中，现已不大使用。 SiN或SiC键型这类固定相比SiOC键型固定相的水解稳定性和热稳定性好，但适用pH值范围窄（pH48），因此实用价值亦不大。 SiOSiC键型SiOSiC键型是一类目前占绝对优势的键合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性，能在pH

6、28的介质中使用。这类键合固定相是硅胶上的硅羟基与有机氯硅烷或烷氧基硅烷试剂反应而得。 单官能团有机硅烷 X 通常为Cl、OH、OCH3、OC2H5等官能团；R 通常为直链或支链烷基、芳香基，如CH3、C4H9、C8H17、C18H37、苯基等，也可以是它们被不同的基团取代后的衍生基团，如(CH2)2CN、(CH2)2NH2、(CH2)nOCH2OH等。 双官能团有机硅烷 双官能团化合物如R2SiX2可单独形成线型或环状有机硅氧烷。三官能团有机硅烷硅烷化试剂中三个X基团都参与硅醇基反应的可能性很小。三官能团化合物如RSiX3反应后的产物可水解进一步形成硅羟基，进而形成三维交联化合物 硅烷化试剂

7、的反应活性为：RSiX3R2SiX2R3SiX。Si-O-Si-C：不水解，热稳定性好，在pH 28范围内对水稳定。聚合层键合相在硅胶表面与硅烷化试剂反应时加入一定量的水，即形成聚合物，可以制备较致密的键合层，从而更有效地掩蔽硅胶表面的硅羟基但若反应控制不当，会产生过厚的聚合网，而引起传质较慢，柱效降低 （4）端基封尾残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生一定影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇基的存在会降低硅胶表面的疏水性，而对极性化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能改变。原 因（4）端基封尾用氯化三甲基硅烷等试剂与硅胶表面的残留硅醇基反应，将残留硅醇基封锁起来的化学处理过程称为端基封

8、尾。定 义（4）端基封尾为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键合反应后再用封尾剂钝化，也可用十八烷基三氯硅烷再键合一次。 方 法最常用的封尾剂有三甲基氯硅烷（TMCS）和六甲基乙硅氧烷（HMDS）以外，现已研制出三甲基硅咪唑（TMSI） 三甲基氯硅烷十八烷基（4）端基封尾经封尾处理的硅胶基质固定相减小了溶质与固定相之间的次级相互作用，使分离效果明显改善。可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好；如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 作 用（4）端基封尾极性封尾技术制作的新型键合固定相也

9、较多，如AquaTM Phenonmenex、SynergiTM Hydro-RP、YMC-PACKTM ODS AQTM 双封端以及三封端技术的色谱柱，如ZORBAX Extend-C18，ZORBAX Bonus-RP不封端的色谱柱：键合了带有较大空间位阻的侧链基团，ZORBAX StableBond HPLC柱 进 展2、常见的官能团 十八烷基硅烷键合硅胶(octyldecylsilica)（ODS）氰基氨基苯基3、常用的键合相商品牌号安捷伦公司（Agilent）Waters公司瑞典Akzo Nobel公司Merck公司（1）Agilent公司Zorbax由著名的色谱科学家Kirklan

10、d研制，并由杜邦公司所生产和销售的系列色谱填料的注册商标。现在，Zorbax的全部生产线已并入Agilent公司，所以Zorbax亦全部转入Agilent公司。 另外还有LiChrosorb、LiChrospher等。 （2）Waters公司Waters公司是全球性的液相色谱、质谱及相关产品专业生产厂家，拥有实力雄厚的研究机构和色谱柱生产厂，是唯一同时生产液相色谱仪器、化学品及数据处理系统三大液相色谱要素的专业厂商。 Waters公司旗下的色谱柱品牌有很多，如 BondapakTM，它是能经历20多年但性能基本上保持一致的HPLC色谱柱。XTerra色谱柱使用的杂化颗粒技术突破了化学的极限,是

11、Waters公司历史上HPLC色谱柱销售增长最快的色谱柱家族，无论是药物发现、药物开发，还是进行药物分离和纯化，XTerra杂化颗粒技术都受到制药领域科学家的热烈欢迎，并在2000年度为Waters赢得R&D100大奖。 （3）Merck公司 德国默克公司的高效液相色谱从1970年起步到现在，已有众多知名品牌LiChrosorb、 LiChrospher、Nucleosil、Purospherstar明星家族等。（3）Merck公司 默克公司在1999年成功研制出整体化色谱柱Chromolith并完成产业化生产，使液相色谱的研究和应用跨入了一个全新的时代。Chromolith是目前世界上分析速

12、度最快的色谱柱。2001年3月份，在美国新奥尔良举行的国际色谱会议上Chromolith整体化色谱柱获得“Pitticon EditorsGold Award”；同年9月份，该产品又获得了第38届“R&D 100 World Award”。（4）Akzo Nobel公司 Kromasil是瑞典Akzo Nobel公司的硅胶填料的牌号。Kromasil是一种高纯度、球形硅胶填料。这种填料含碳量高，表面极性小，分离效能高。化学稳定性好，化学纯度高，机械强度高。近年来开始在我国市场上逐渐为人所知。（5）Phenomenex公司 Luna、Synergi、Biosep、PolymerX、Jupiter

13、、Rezex、Chirex、Aqua、Zebron、Prodigy、Phonogel、Curosil、Envirosep、IB-Sil、SRAR-IONA300等 （6）Supelco公司 Discovery 系列快速LC-MS产品是较短的色谱柱，满足了LC-MS分析的需要 4、化学键合相性能评价 由于各种键合相均以硅胶为基质，可以认为是一种改性硅胶。在化学键合相色谱中，代表色谱保留的 k 与键合在硅胶表面有机基团的覆盖量直接有关，因而键合相表面改性的完全程度和重现性是色谱用户和制造厂家共同关心的。重复性和改性完全程度可通过残余羟基，覆盖度和覆盖均匀性表示。测定和评价的方法有微量元素分析、色谱

14、、光谱、核磁共振法等。（1）微量元素分析或热失重法本法直接测定键合相的碳含量，有以下几种表示方法： 表面键合官能团浓度 表面碳覆盖率 有机官能团的表面覆盖度 表面键合官能团浓度 商品键合相：229甲基硅烷键合相：十八烷基硅烷键合相：3420由于C%随基质比表面积（S）和键合有机基团的分子量（M）变化，所以在研究和比较的工作中采用表面键合相浓度表示，即单位表面积所含键合相的浓度（mol/m2）： W为1 g担体上键合有机官能团的质量 （g）；M为键合有机官能团的摩尔质量（g/mol）；S为担体比表面积（m2/g）。 表面碳覆盖率 表面覆盖度即硅胶表面含碳的质量百分数。式中，12为碳的原子量；Nc

15、为键合有机官能团的碳数，W、M含义同上。 有机官能团的表面覆盖度 键合程度也可用有机官能团的表面覆盖度表示，即在单位表面积上已键合的有机官能团的量（mol）与可反应的硅醇基的量（mol）之比。 (2) 色谱法 对反相填料在甲醇-水条件下考察对芳烃、苯、萘、联苯的分离情况。用非极性键合相填料正相洗脱的方法检查残余羟基的含量，即用庚烷作流动相。若残余羟基甚少，则象甲醇、丙酮等极性化合物的保留时间与tm相近，且峰形对称。若残余羟基甚多，则情况相反。这种方法评价较为多客观。(3) 光谱法 这是基于Si-OH基在3750cm-1处有特征的红外吸收谱带，借此可以获得某些信息。漫反射红外光谱可区分硅氧烷（8

16、10 cm-1和1110 cm-1 ）、孤立硅羟基（3700 cm-1 ）、邻位或偕位硅羟基（3600 cm-1 ）。魔角探头固体核磁共振法可以区分邻位和偕位硅羟基，但是不能区分孤立和键合硅羟基位点。 5、使用键合固定相应注意的问题（1）硅胶键合相的稳定性键合相的使用寿命取决于键合的有机官能团在硅胶表面的覆盖程度，显然当覆盖量大或呈多分子覆盖层时，会增加其稳定性。通常，正相键合相的稳定性要低于反相键合相。反相烷基键合相的稳定性与使用的流动相的pH值有关，通常水溶液的pH值应保持在28之间。硅胶中的残留硅醇基会对色谱分离产生不良影响。5、使用键合固定相应注意的问题（2）键合相色谱分离的重现性 使

17、用键合相时经常会遇到，同一种类型的键合相，因生产厂家不同，或生产批号不同，而表现出不同的色谱分离特性。对各种型号的键合相，由于制备时选用基体硅胶特性的差别，和键合反应时官能团覆盖量的不同，会产生“载体诱导选择性的变化”。5、使用键合固定相应注意的问题(a)(b)(c)(d)(e)在5种不同型号ODS-硅胶化学键合相上7种多环芳烃混合物的分离固定相: (a) HC-ODS(8.5%); (b) Lichrosorb RP-18(19.8%)(c) Partisil-10ODS-2(16%); (d) Zorbax ODS(10%);(e) -Bondapak C18(10%)(括号内为含碳量)5、使用键合固定相应注意的问题（3）键合相色谱分离的选择性 在反相色谱分析中，使用同一种ODS固定相，并用两种极性参数P值相近，但由不同溶剂组成的流动相时，会由于“溶剂诱导选择性的变化”，而获得不同的分析结果。(b) 32.5%四氢呋喃-水溶液， P=8.1854