分子荧光和化学发光

1、1分子荧光光谱法最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同根据实验现象，对于荧光来说当激发光停止照射后，发光过程立即停止（10-910-6s），而磷光则将持续一段时间（10-310s）2测量荧光强度，定量测定许多无机和有机物物质 特点： 1)分子荧光光谱法具有很高的灵敏度 2)荧光法的选择性也比分光光度法好某些无机阴离子会使其他物质的荧光由于熄灭效应而减弱强度，根据这一效应也可用来测定这些离子的浓度 3一、荧光光谱的产生1.荧光光谱一个分子的电子能态的激发包含了电子从基态跃迁到激发态的任一振动能态，处在激发态的分子是不稳定的，还可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回

2、基态，其中以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势在溶液中这种激发态分子很容易与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失其振动能，而后下降至第一电子激发态的最低振动能级（无辐射的跃迁），然后再以辐射形式跃迁至电子基态的任一振动能级，即产生荧光，并进一步以无辐射跃迁的形式回到基态的最低振动能级4分子吸收和荧光光谱跃迁示意图 能量分子吸收和荧光光谱跃迁示意图 分子吸收和荧光光谱跃迁示意图 E0V05荧光和磷光体系能级图6由于无辐射跃迁几率较大，因此分子荧光波长比激发光长，只是对应于基态和激发态的两个最低振动能级的跃迁，激发光和荧光的波长才相同，这种荧光称为共振荧光（resonance fluorescenc

3、e）7(1)振动弛豫 当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层跃迁到激发态的较高的振动能层上去然而，在液相或压力足够高的气相中分子间碰撞的几率很大，激发态分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围的分子，而自身从高振动能层失活到该电子能级的最低振动能层上，这一过程称为振动弛豫发生振动弛豫的时间为10-12s数量级8(2)内转换 内转换指的是相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程当两个电子能级的振动能层间有重叠时，则可能发生电子由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子的激发态内转换过程在10-1310-11s时间内发生，它通常要比由高激发态直接发射光子的速度快得多 9(3)外转换 激发分子

4、通过与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程称外转换这一现象称为“熄灭”或“猝灭”自较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换，也可包含内转换10(4)系间跨跃系间跨越指的是不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程它涉及受激 电子自旋状态的改变如S1到T 1，使原来两个自旋配对的电子不再配对这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子能态的振动能层有较大的重叠时，如图中激发单重态S1的最低振动能层与激发三重态T1的较高振动能层重叠，则可能通过自旋轨道耦合等作用使S1态转入 T1态的某一振动能层 11(5)磷光发射从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快

5、速的振动弛 豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在10-410s左右时间内 跃迁回基态而发生磷光12Stokes位移荧光发射光谱与激发波长的选择无关镜像规则二者呈镜像对称关系2. 激发光谱和发射光谱及其特征Link13 二、荧光强度与浓度的关系 分子产生荧光必须具备两个条件：()分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；()吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率 荧光量子产率()也称荧光量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式 表示 14许多吸光物质并不能发射荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除荧光发射外，还有许多上

6、节所述的辐射和非辐射跃迁过程与之竞争荧光的量子产率与上述每一个过程的速率常数有关可以数学式表示如下15式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其他有关过程的速率常数的总和从上式可知，凡是能使kf值升高而使其它ki降低的因素，都可增强荧光一般说来，kf值主要取决于化学结构，而ki则主要决定于化学环境，同时也与化学结构有关16分子的荧光强度与溶液的吸收强度成正比，即 If=K(I0-I) (1) 式中I0为照到溶液上的激发光强度，I为通过长度为b的溶液后的光的强度，是与荧光量子效率等有关的常数比尔定律写成如下形式(2)17式中是荧光分子的摩尔吸光系数，将式（2）代入式（1），则If =I0 (1-

7、10-bc) （3）将式（3）中的指数项展开(4)18对于很稀溶液，投射到溶液上被吸收的激发光不到2 %时，也即bc0.05时，上式括号中后面几项与第一项相比可以忽略不计，则上式可简化为 If =2.3I0bc （5）当激发强度一定时 If =kc19在浓度c低时，溶液的荧光强度与荧光物质浓度的关系曲线呈线性符合这一直线关系的荧光物质的最大浓度为0.05/b左右浓度变大时，曲线弯向浓度轴且往往产生一极大值 20在高浓度时，使这一线性关系发生负偏离的另外两个因素是自熄灭和自吸收前者是由于荧光分子之间以及荧光分子同溶剂分子之间的碰撞，引起了非辐射的能量转换所造成的自熄灭现象将随浓度的增大而增大自吸

8、收则发生在荧光发射波长同化合物的吸收峰重叠的情形下，当荧光通过溶液时便被减弱了21三、荧光计和荧光分光光度计用于测量荧光的仪器种类很多，从简单的滤光荧光计到复杂的精密荧光分光光度计所用仪器的各部件和分光光度计相类似(下图)仅讨论其差别 22荧光仪示意图231 激发光源荧光测量中所用激发光源一般比吸收测量中的光源强度大，通常采用汞弧灯、氢灯或氙灯2 滤光器和单色器在荧光计中使用滤光片两个单色器24 3 检测器荧光的强度很弱，因此要求检测器有较高的灵敏度一般用光电管或光电倍增管作光电元件 4 试样液池荧光测量用的液池通常用石英制成，形状以正方形或长方形为宜，也有用圆形的25荧光强度与透过光强度相比

9、小得多，因此在测量荧光时必须严格消除透过光的影响在测量荧光的仪器中，是在与入射光和透过光相垂直的方向上来测量荧光26影响荧光强度的因素1. 分子结构通常具有强荧光分子都具有大的共轭键结构、供电子取代基、刚性的平面结构等，这有利于荧光的发射，因此分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光。27饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。 (1)跃迁类型经验表明，大多数荧光化合物是由或跃迁而产生的，其中跃迁的量子化效率高。28(1)共轭效应含有跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强，最有用。含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧光，但这类化合物的数量比芳香族少。稠环化合物

10、一般会产生荧光。最简单的杂环化合物，如吡啶、呋喃、吡咯和噻吩等不产生荧光。29(3)取代基效应苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。通常，给电子基团，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3、-N(CH3)2等，使荧光增强，吸电子基团，如-Cl、-Br、-I、-NHCOCH3、-NO2、-COOH等，使荧光减弱。30(4)结构刚性效应实验表明，具有刚性结构的分子容易发生荧光。该结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子间的相互作用减小（降低外转换的概率），也就减少了碰撞去活的可能性。31酚酞荧光素联苯(0.18)芴(1)322. 化学环境(1)溶剂效应通常，增大

11、溶剂极性，跃迁的能量减小，使荧光光谱向长波方向移动，即红移。(2)温度 通常，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强度随温度降低而增大，并伴随着光谱的蓝移。(3)溶液的pH 溶液的pH对含有酸性或碱性基团的荧光物质有较大影响。33四、荧光定性和定量分析1荧光分析法的特点（1）灵敏度高 与紫外-可见分光光度法比较，荧光是从入射光的直角方向检测，即在黑背景下检测荧光的发射（2）选择性强 荧光法既能依据特征发射，又能依据特征吸收来鉴定物质（3）试样量少和方法简便（4）提供比较多的物理参数 34荧光分析法能提供包括激发光谱和发射光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等许多物理参数这些参数反映了分子的各种特性，

12、能从不同角度提供被研究的分子的信息 荧光分析法的弱点是它的应用范围还不够广泛另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素敏感，干扰因素也较多 目前荧光分析大多用于定量测定 352. 应用 荧光光普法主要应用于元素的荧光测定以形成荧光配合物进行荧光分析的元素目前已达60余种，其中铍、铝、硼、镓、硒、镁以及某些稀土元素常用荧光法进行测定可采用荧光猝灭法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍等 36荧光法定性和定量分析方法与紫外及可见吸收光谱法相似，由实验得到的样品的荧光激发光谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图比较可定性分析样品成分在进行定量分析时，一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长，以

13、发射光谱最大峰值波长为发射波长37荧光法同样也可用于混合物的同时测定和络合物组成的研究应用有机试剂可以扩大其应用范围，缺点是同一种有机试剂与不同金属离子组成的络合物的荧光峰值常常很接近，会给多种元素测定带来困难383.9 化学发光分析法简介 基于化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法，这种分析方法具有灵敏度高、测定线性范围宽、仪器设备简单、分析速度快且易实现自动化等优点 39化学发光的能量水平与荧光相同，引起发光的激发方式不同。为了产生化学发光，反应必须产生能够发出可见光的激发产物。只有热效应可以产生足够的能量，所以几乎所有的化学发光反应需要氧、过氧化氢或其它强氧化剂。40任何一个

14、化学发光反应都包括两个步骤，即化学激发和发光，如下式所示： A + B C* + D （激发） C* C + hv （发光）间接的化学发光则按如下反应发生： A + B + C AB + C* （激发） C* C + hv （发光）这种由于加入发光能量接受体C所导致的化学发光称为敏化化学发光或活化化学发光一、化学发光反应的条件41化学发光反应可以在气相、液相或固相进行，分别称为气相化学发光、液相化学发光或固相化学发光若化学发光在两个不同相间进行就称为异相化学发光42化学发光反应都包括化学激发和发光两个步骤，则有 CL= CEEN (1)式中CL为化学发光效率；CE为生成激发态分子效率；EN为激

15、发态发光效率，CL、CE分别定义为：43则化学发光的效率为：44 一个化学反应要成为化学发光反应必须满足下面几个要求： 化学反应要提供足够的能量生成激发态，也就是要有足够的激发能E激发能的主要来源是反应焓Hr大多数的化学发光反应实例中，观察到的光子能量均比Hr大在Hr的条件下，将要由反应的活化焓H*提供这种附加的能量因此，必须有： HrH* 45满足上式只是满足产生化学发光的必要条件而不是充分条件，有机发色基激发态的能量E通常在0.120.25Jmol-1（对应于570280nm）范围若在整个可见紫外区（760280nm），则E处在0.0920.25Jmol-1之间这个能量要求化学反应提供，在

16、多步骤反应中，由于化学激发的瞬时性，这个能量必须由某一步骤单独提供，否则前一步反应释放的能量将因振动松弛消失在溶液中而不遗留至下一步46至少要有一种物质能够接受化学反应的能量生成激发态换句话说，也就足要有足够的激发效率CE对有机分子的液相化学发光来说，从能量上看，容易生成激发态产物的常是芳香族化合物和羰基化合物47在反应条件下激发态分子能够以电磁辐射的形式释放能量回到基态若CN很低，由式（1）可知，即使化学激发效率CE很高，化学发光效率CL也是低的这种情况下，若加入适当高效率的接受体，使能量转移到接受体上而发光，就会大大提高发光效率，而在计算化学发光效率时，就得加入一项能量转移效率ET48二、

17、化学发光分析的基本原理化学发光分为快发光和慢发光化学发光的反应过程可用发光强度与时间的关系曲线来描述（图13-13）图中t1为化学发光峰值出现的时间，t2为化学发光峰值衰减了90%时的时间对于快发光，t11s，化学发光衰减时间即t2t15s；对于慢发光来说t2t15s还有一种慢发光，如图13-13b中所示，化学发光强度在一段时间基本保持不变，然后再较快的上升或下降49图13-13 化学发光的动力学曲线50设某分析物与过量试剂作用而发光，则此时的化学发光强度与分析物浓度有如下关系 式中，ICL(t)为在时刻t的化学发光强度，以每秒产生的光量子数表示，为化学发光效率，-dc/dt为分析物参加反应的

18、速度，即每秒参加反应的分子数(2)51对于一级或假一级反应t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比通常在化学发光分析中采用测量峰高利用峰高与分析物浓度的线性关系进行定量分析 52为了提高测量的灵敏度，也可采用测量峰面积，即在一定时间间隔内对化学发光强度进行积分，得到发光强度的积分值：(3)53t1和t2若为反应过程中的某一段时间间隔，则积分值只是部分化学发光强度的积分值如果t1取零，t2取反应结束所需时间，得到的就是整个反应产生的总发光强度它相当于图13-13中动力学曲线下的整个峰面积，它与分析物浓度存在线性关系这种分析方法实质上是一种平衡法，特别适于慢的化学发光54化学发光反应对指定的

19、测定最好是专属的（如酶法化学发光），这样就不需实行光学分辨或化学方法排除干扰如一个化学发光反应中出现不同的激发态分子，这就需要光分辨，选择测定所感兴趣的化学发光，用一个滤光片就可达到目的55若参加反应的试剂可与各种分析物反应产生发光现象，由于化学发光光谱均相同，利用光分辨将无意义，需要采用其他方法排除干扰例如，许多金属离子能催化鲁米诺-H2O2化学发光，可利用色谱技术分离或化学掩蔽方法等手段达到分析目的许多化学发光的强度与分析物质的浓度在几个数量级之内呈良好的线性关系 56三、化学发光反应的类型1 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物

20、分子，此初始激发态能辐射光子表示如下：A + B C* + D C* C + hv 式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*当C*跃回激态时，辐射出光子57间接化学发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始激发态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃回基态时，产生发光如下式表示： A + B C* + D C* + F F* +E F* F + hv式中C*为能量给予体，而F为能量接受体例如，用罗丹明B没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3，其化学发光反应就属这一类型58没食子酸 + O3 A* + O2A* + 罗丹明B 罗丹明B* + B罗丹明B* 罗丹明

21、B + hv没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射光子，该光辐射的最大发射波长为584nm592 气相化学发光和液相化学发光气相化学发光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等NO与O3的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + hv60反应的发射光谱范围为666875nm，灵敏度可达1ng/ml也可同时测定大气中NO2的含量，将NO2还原为NO，测定二者

22、的总量，再减去NO的量液相化学发光几种体系 鲁米诺和光泽精61光泽精光泽精(N,N-二甲基-9,9-联吖啶二硝酸盐)在碱性溶液中与H2O2反应生成激发态的N-甲基吖啶酮，产生最大发射波长为470nm的化学发光，CL=0.010.02，反应历程为62利用金属离子对该体系的催化作用可以测定Mn2+，Ag+，Fe2+，Fe3+，尤其是鲁米诺体系不能测定的Pb2+、Bi3+等离子基于对该体系化学发光的增强作用可以测定丙酮、尿素、甘油、羟胺、抗坏血酸、肌酸肝、葡萄糖、谷胱甘肽和果糖等633 异相化学发光和生物化学发光异相化学发光 如在含有罗丹明B和没食子酸的硅胶上，O3与没食子酸反应生成高能中间体A*，

23、然后将能量转移给罗丹明B接受体而发光： 参见55该反应用于气球探测器或气相卫星上，以便测定大气或同温层的O3含量64生物化学发光 荧火虫素与三磷酸腺苷（ATP）反应，在萤火虫素酶（E）与Mg2+存在时生成萤火虫素与一磷酸腺苷（AMP）的复合物和焦磷酸镁，然后复合物与氧发生化学发光反应，CL接近于1 该体系可测定210-17molL-1的ATP，这相当于一个细菌的ATP含量，灵敏度很高，选择性很好65 细菌发光也可用于发光分析在发光细菌的荧光素酶(E)催化下，还原型的黄素单核苷酸（FMNH2）在八碳以上长链脂肪醛参与下，被O2氧化，产生化学发光66由于氧化型的黄素单核苷酸（FMN）可与烟酰胺腺嘌

24、呤二核苷酸（NADR）发生下列反应：所以，将以上两个化学发光反应耦合可灵敏地测定样品中的NADH676869四、鲁米诺化学发光反应的机理在常用的化学发光分析的发光物质中，鲁米诺的应用最广泛深入的研究已经给出鲁米诺化学发光反应机理的初步模式它产生化学发光反应的CE为0.010.0570鲁米诺被氧化发光的整个过程如下： hv(max=425nm） 71鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中可被一些氧化剂氧化，产生最大发射波长为425nm的化学发光发光过程有两种方式，即单电子氧化和双电子氧化，单电子氧化得到中间体鲁米诺游离基；双电子氧化得到中间体叠氮醌，而最后发光体是3-氨基邻苯二甲酸根阴离子在

25、碱性溶液中，I2与鲁米诺的化学发光反应属于双电子氧化过程，该化学发光体系可检测碘的浓度低达510-10molL-172金属离子催化鲁米诺-H2O2体系的化学发光反应大都属于单电子氧化过程例如： Mn+ + HO2-Mn+HO2- Mn+HO2-+鲁米诺H2OM(n+1)+ 鲁米诺游离基3OH- 鲁米诺游离基+HO2-化学发光上述历程中Mn+（如Co2+）参与了反应，价态升高，本身是还原剂73四、液相化学发光的测量仪器大多数化学发光和生物发光测量仪器称为光度计，因为这类仪器只有光电检测，没有单色器提供光色散也有人称这类仪器为发光光度计商品名称则更为多种多样液相化学发光的一个重要优点是仪器比较简单

26、，一般仅有进样系统和检测系统组成 74化学发光仪示意图751. 进样系统进样系统包括化学发光反应地、试样注射器、聚光和控温装置等保证试样能在反应池内均匀混合，产生的光辐射供检测系统检测进样分静态注射和流动注射两种方式（1）试样反应池 反应池的材料可根据不同要求选择玻璃、石英或塑料等，池的形状要与光电管的有效接受面积相匹配若为流动分析则他的形状、大小都要严格要求76（2）进样器 在静态注射进样方式中，进样器通常为微量吸量管或各种形式的注射器，容积从微升到毫升不等若为流动注射进样方式，用泵代替注射器或加有注射阀77（3）聚光装置 为了提高检测效率，通常在试样池的后方装一聚光装置这种装置可以是凹面镜

27、，简单的也可用一平面镜，也可直接在池子外面半圆圈周上镀一个镜面，使化学反应的光辐射能有效地到达光电管接受面好的聚光装置可使进入检测器的光达50%78（4）进样方式 在静态注射进样方式中，可以是反应物混合后最后注入分析物，也可以是分析物与介质混合后再注入反应物应根据分析要求和反应体系特点，选择最佳进样程序静态进样的优点在于反应条件容易选择且使用方便，仪器价格也较低廉79在流动注射进样方式中，传递分析物和反应物都是通过泵来实现的，它的反应池是一个透明性良好的盘管分析时用泵驱动试剂进入流动系统，样品经注入阀注入到反应试剂的溪流中，试剂和试样在流动过程中进行混合（主要在盘管中混合），并在盘管中产生化学

28、发光，用置于盘管正前方的光电倍增管检测光信号流动注射式自动化程度高、分析速度快，便于连续监测和批量分析另外，流动注射分析的准确度和精密度也较好 802. 检测系统检测系统包括光电转换、信号放大、信号处理和数据显示等部分光信号转换为电信号由光电倍增管来完成对于某一特殊用途的仪器，仅要求检测器的光谱响应最大值与指定应用体系的化学发光光谱峰值相同或相近即可；对通用仪器，则管子光阴极的光谱响应范围越宽越好，以适应各种不同的发光体系81五、影响液相化学发光强度的主要因 1溶液酸度 不同的化学发光体系要求在不同的pH值下进行才能获得最大的发光强度试液的酸度会影响发光活性物质的有效浓度，对化学发光强度直接产生影响，所以反应液及试液的酸度对化学发光强度影响很大每个发光体系的最佳酸度都应该通过实验确定并严格进行控制822试液的注入速度 在固定其他条件的情况下，一般来说，试液注入的速度越大，体系发光强度的线性变化也越大所以，对静态注射式液相化学发光仪来说，开启试液活塞的速度应尽量快且每次要均匀一致这样，可使分析结果既有高的灵敏性又有好的重现性833干扰物质的存在 在痕量分析中，有微量的干扰物质存在便会引起污染而导致试验失败所以，所用的仪器必须清洁，试剂纯度要高，蒸馏水的本底值应尽量低且应进行