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文档简介

1、第二节 基因工程的基本操作程序人教版高中生物学教材生物技术与工程(选择性必修三)第三章主讲人:田梦丽 学 校:深圳科学高中问题探讨苏云金杆菌培育转基因抗虫棉需要哪几步?Bt基因表达苏云金伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)摄食害虫死亡苏云金杆菌与载体拼接 普通棉花(无抗虫特性) 棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程问题探讨基因工程的基本操作程序(4个步骤)1234目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的筛选与获取一、目的基因(1)概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因;与生物抗逆性、优良品质、

2、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。(Bt抗虫蛋白基因:转基因抗虫棉)。主要是编码特定蛋白质的基因,也可以是具有调控作用的因子(2)实例:目的基因的筛选与获取二、筛选合适的目的基因方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心越来越多基因的功能和结构被分析。目的基因的筛选与获取三、目的基因的获取方法:利用PCR获取和扩增目的基因聚合酶链式反应,根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。概念目的基因的筛选与获取体内DNA复制要点回顾(1)条件原料:游离的脱氧

3、核苷酸(A、T、G、C)模板:DNA的两条链酶:DNA解旋酶、DNA聚合酶等能量:ATP(2)复制原则碱基互补配对原则(保证复制的准确进行)目的基因的筛选与获取三、目的基因的获取方法:利用PCR获取和扩增目的基因聚合酶链式反应,根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。概念条件Taq酶(热稳定DNA聚合酶)目的基因(模板DNA)四种游离的脱氧核苷酸引物:核苷酸聚合作用的起始点目的基因的筛选与获取三、目的基因的获取过程模板DNA变性 复性 延伸 方法:利用PCR获取和扩增目的基因553395目的基因的筛选与获取过程951.

4、变性:加热至9095,双链DNA间的氢键断裂,解旋为单链。变性 复性 延伸 三、目的基因的获取三、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因5353使用耐高温的Taq酶保证高温条件下仍具有活性。目的基因的筛选与获取50引物1引物2DNA引物2.复性:冷却至5560,两条引物与单链DNA结合过程三、目的基因的获取三、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因变性 复性 延伸 5353引物结合在模板DNA链的3端,新合成的子链方向为5到3。目的基因的筛选与获取过程引物1引物272Taq酶Taq酶变性 复性 延伸 3.延伸:加热至7075,以目的基因为模板,合成互补的新DNA链。三、目的基因的获取三

5、、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因53533553目的基因的筛选与获取第1轮结束第2轮开始第一轮结束:此时目的基因的量是原始的2倍。三、目的基因的获取过程变性 复性 延伸 三、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因53533535目的基因的筛选与获取三、目的基因的获取过程955072TaqTaqTaqTaq变性 复性 延伸 三、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因目的基因的筛选与获取三、目的基因的获取过程955072TaqTaqTaqTaq变性 复性 延伸 三、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因目的基因的筛选与获取第2轮结束第二轮结束:此时目的基因的量是原始的22倍

6、。三、目的基因的获取过程变性 复性 延伸 三、目的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因目的基因的筛选与获取三、目的基因的获取扩增方式:利用PCR获取和扩增目的基因以指数方式扩增,即_(n为扩增循环的次数)2n(1)若开始只有一个DNA提供模板,则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。(2)若开始有N个DNA提供模板,则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。2nN2n目的基因的筛选与获取碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶解旋酶催化体外复制细胞内(主要在细胞核内)耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶DNA在高温下变性解旋大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR与DNA复制过程比较三、目

7、的基因的获取利用PCR获取和扩增目的基因基因表达载体的构建 一、基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,且可以遗传给下一代;(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 二、基因表达载体的组成位置:功能:RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质。基因的首端(一段有特殊结构的DNA片段)人们所需要的基因位置:功能:基因的尾端(一段特殊的DNA片断)终止mRNA的转录用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞基因表达载体的构建 三、基因表达载体的构建过程基因表达载体构建模式图载体(质粒)DNA分子(含目的基因)限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同

8、黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子(重组质粒)同一种培育抗虫棉的简要过程使用一种DNA限制酶进行切割,共有几种连接情况?问题探讨应用过程中往往选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割,减少自连情况出现;载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接 反向连接112212212211培育抗虫棉的简要过程将目的基因导入受体细胞 一、农杆菌转化法-双子叶植物目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中重组DNA转入杆菌农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞 含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中目的基因

9、遗传特性稳定维持和表达农杆菌转化法步骤:培育抗虫棉的简要过程将目的基因导入受体细胞 二、花粉管通道法在植物授粉后一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴在花柱切面,使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;花粉管通道法导入外源DNA培育抗虫棉的简要过程将目的基因导入受体细胞 三、显微注射法-动物细胞目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物显微注射技术个体大,易操作。受精卵全能性高,易培养成完整个体。培育抗虫棉的简要过程将目的基因导入受体细胞四、Ca2+处理-原核细胞(1)使用Ca2+处理:可使细胞处于一种能吸收周围环境中

10、DNA分子的生理状态。(2)过程繁殖快,单细胞,遗传物质相对较少。Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子原核细胞(大肠杆菌)大肠杆菌细胞目的基因的检测与鉴定检测是否插入目的基因检测目的基因是否转录检测目的基因是否翻译基因表达的过程生物是否具有新目的基因的检测与鉴定 一、分子水平的检测(1)检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法:PCR扩增或DNA分子杂交技术M:marker;1-阳性质粒;2:原始品系;3-9转Bt品系;转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA分子杂交(Southern-blot)流程图DNA分子杂交结果图目的基因的检测与

11、鉴定 一、分子水平的检测(2)检测目的基因是否转录出了mRNA方法:PCR扩增或分子杂交技术RNA分子杂交(Northern Blot)流程图Bt基因在抗虫棉中的表达从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片,苞叶,花,雌雄蕊和铃壳目的基因的检测与鉴定 一、分子水平的检测(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原-抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交目的基因的检测与鉴定转Bt基因非转基因 二、个体水平的检测抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株接种棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法分子检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR扩增DNA分子杂交技术第二步目的基因是否转录出mRNAPCR扩增分子杂交技术第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测;基因工程产品与天然产品的功能活性

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