娄加陶-ct-DNA在肺癌个体化诊断运用之路 上海市胸科医院

1、ct-DNA在肺癌个体化诊断之路娄加陶上海市胸科医院循环肿瘤DNA ( Circulating Tumor DNA, ctDNA)来源：1、坏死的肿瘤细胞；2、凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、肿瘤细胞分泌的外排体。特点： 肿瘤细胞释放到血浆中的单链或双链DNA； 携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变 突变 缺失 插入 重排 拷贝数异常 结构变异 甲基化 具有对癌变组织的代表性，克服肿瘤组织异质性问题Nat Rev Cancer. 2017 Apr;17(4):223-23液体活检的时代来临：ctDNA成为肿瘤治疗中的有力补充手段首次描述了游离核酸存在于人的血液中，但在肿瘤领域并未引

2、起关注液体活检时代的来临：ctDNA的临床实践癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异，ctDNA的重要性得到关注ctDNA精准医疗里程碑Genomics Proteomics Bioinformatics 15 (2017) 59-72ctDNA的特点 片段短（180-200bp） 含量极低 1 ml血液中只有十几纳克（ng）的血浆游离DNA（cfDNA）。 ctDNA只占cfDNA很小的比例（0.01%-1%）。 含量与肿瘤类型、肿瘤负荷和肿瘤进展等相关。Trends Genet. 2016 Jun;32(6):360-71. 半衰期短（2小时）Nat Rev Clin Oncol. 20

3、13 Aug;10(8):472-84. .Nat Med. 2008 Sep;14(9):985-90.临床样本中ctDNA的分布特点ctDNA在很多肿瘤中都能被检测到含有转移灶的肿瘤患者ctDNA含量更高不同肿瘤血液中ctDNA含量存在差异ctDNA在晚期肿瘤患者血液中含量更高Sci Transl Med. 2014 Feb 19;6(224):224ra24.ctDNA在临床应用领域的重要价值早期筛查或诊断克隆进化分子分型ctDNA监测病情进展残留病灶评估Nat Rev Cancer. 2017 Apr;17(4):223-238.ctDNA在临床应用领域的重要价值2. 肿瘤动态监测1.

4、 术后判断多次取样定性定量检测肿瘤负荷，追踪药物响应J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86.与标准CT影像学相比，ctDNA可提前11个月检测到肿瘤复发EMBO Mol Med.2015 Aug;7(8):1034-47.3. 用药指导4. 异质评估ctDNA能反馈肿瘤进化，新生突变Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ra133.ctDNA能有效反映病人对药物治疗的响应Nat Med.2014 May;20(5):548-54.非小细胞肺癌患者的EGFR基因相关突变 EGFR基因突变概率： 特征人群：北美和西欧10%东

5、亚30-50%亚裔、女性、无吸烟史、腺癌 常见EGFR基因突变类型： COSMIC数据库目前显示EGFR基19-Dels（45%）L858R（40-45%）因有近千个突变位点T790M（TKI耐药的50%以上） EGFR基因突变是一线EGFR-TKIs治疗的重要靶点和关键性预测标志物 多个指南均强调治疗前的基因检测Nat Rev Cancer. 2007 Mar;7(3):169-81http:/cancer.sanger.ac.uk/cosmic.NSCLC分子靶点与靶向用药17年3月24日，三代TKI奥希替尼国内上市。中国NSCLC人群：3040%白种NSCLC人群：1020%在靶向治疗前

6、有必要对相关分子靶点进行检测Vari S, et al. Expert Opin Drug Discov, 2013.肺癌治疗策略的变革ClinicalOnocologyPathologyOnocologyMolecularOnocologyPrecise TherapyDiseaseGuidedPathologyGuidedMolecularDiagnosticsLess choices：SurgeryIncreasedtherapeuticoptionsThe mutations ofdriver genes astargetsRadiotherapyaccording todiffere

7、nt tumortypesChemotherapyPresented By Enriqueta Felip at 2015 ELCC;临床的问题和需求再活检和动态监测困难没有足够的肿瘤组织肿瘤异质性（时间和空间）侵袭性非侵袭性静态 动态单基因 多基因靶向耐药不可避免Camidge DR, et al, Nature Rev., 2014,11,473T790M突变是主要的耐药机制Yu H A et al. Clin Cancer Res 2013; 19: 2240-2247T790M突变：一代二代TKI耐药的主要机制2361G 2369CAT(T790M)野生型EGFREGFR伴T790M突

8、EGFR基因空间构象解释T790M耐药机制:T790M突变后，氨基酸侧链变大（苏-蛋），出现空间位阻，阻碍了TKI与EGFR的结合变T790M位点附近存在的SNP影响T790M的检出率Juchum M, et al. Drug Resist Updat.2015 May;20:12-28Sanpeng Xu, et al. Oncol Lett, 2016;12:4238-4244T790M组织检测的空间异质性30位TKI耐药后接受多位点再次活检患者的T790M状态BiopsySite 1T790M BiopsyT790MPatients/Site 2/Patient 1Patient 2Pa

9、tient 3Patient 4Patient 5Patient 6Patient 7Patient 8Lung tumorLung tumorLung tumorBrain tumorBrain tumorCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSF其中22例匹配的胸部和脑部标本Pleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural

10、effusionLung tumor胸部总计脑部+2-+-02Patient 9Patient 10Patient 11Patient 12Patient 13Patient 14Patient 15Patient 16Patient 17Patient 18Patient 19Patient 20Patient 21Patient 22Patient 23Patient 24Patient 25Patient 26Patient 27Patient 28Patient 29Patient 30101210 2010 22总计Lung tumorLung tumorLung tumor一致性

11、:12/22（55%）Pleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionClavicular LNLung tumorLung (primary)Lung tumorLung tumorCSFCSFCSFCSFAkito Hata, et al. JTO, 2015CSFPleural effusionLung (meta)Pleural effusionPleural effusionSkin tumorPleural effusionClavicular LNPericardial

12、 effusionAbdominal LNLung tumorLung tumorLung tumorT790M组织检测的时间异质性24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均检测T790M突变状态5位患者停止 TKI治 疗一段时间后，T790M 状 态从阳性变成阴性实时监测的必要性！1位患者在接受高剂量的厄洛替尼后脑脊液的T790M 由 阴性转阳性 :代表接受TKI治疗；：代表停止TKI治疗A ：阿法替尼；III ：三代TKI；B ：贝伐单抗；H-E：高剂量erlotinib；G：易瑞沙Akito Hata, et al. JTO, 2015耐药T790M突变检测挑战？ 373

13、例初治的患者，298例患者存在T790M突变，比例高达约80% 突变丰度1% 的患者比例仅为2%；高灵敏度检测方法的必要性！Masaru etal, Clin Cancer Res(2015)二、如何做？1、样本来源多种样本的获取方式和优缺点1. 组织活检（肿瘤蜡片）2. 细胞学标本（恶性胸水）3. 血液标本（ctDNA)样本品质和肿瘤细胞含量可能比组织样本较低当无法获取组织或细胞学样本时，作为有效补充过往的检测金标准DNA 片段/假阴性较多，需要高敏感度方法-+-+-侵入性每个病人都适用+-动态检测对于组织和胸水都取不到的患者，血液样本是一个很好的补充Pirker R et al. J Th

14、orac Oncol 2010; Savic S et al. Br J Cancer 2008; Rekhtman N et al. J Thorac Oncol 2011;Tanaka T et al. Cancer Sci 2007组织/细胞学检测是目前的金标准，但仍有局限部分患者无组织标本或无足够的组织标本进行基因检测由于肿瘤异质性，重复活检和动态检测困难仅根据初诊时标本指导后续治疗可能产生偏倚1. Pirker R et al. J Thorac Oncol 2010;5:17061713;2. Marchetti A and Normanno N. Patholgica 2010;

15、102:119122;3. Eberhard D et al. J Clin Oncol 2008;26:983994;4. Kimura H et al. Br J Cancer 2006;95:95:13901395;5. Oshita F et al. Br J Cancer 2006;95:10701075;血液检测的优势指导用药匀质标本实时监测作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药循环而匀质的血液标本，在一定程度有效克服异质性实现实时动态监测，提高全程管理水平1. Molina-Vila M et al. J Thorac Oncol 2008;3:122412

16、35;2. Smouse J et al. Cancer Cytopathol 2009;117:6772;3. Van Ejik R et al. PLoS One 2011;6:e177791;4. Rekhtman N et al. J Thorac Oncol 2011;6:451458EGFR 基因突变检测在临床实践上的问题 研究表明，21.5%的非小细胞肺癌患者初诊时无法获取，或获取到非常有限的活检组织开展后续检测 研究表明，45%的一代TKI耐药患者因为各种原因无法接受二次活检，难以通过二次活检实时监控耐药进展情况。Kaname N, et al. Lung Cancer 201

17、6;101:1-8. Cancer Sci. 2016 Jul;107(7):1001-5.ctDNA的临床应用逐渐形成共识非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识2018版- 2018肺癌患者EGFR/ALK-TKI治疗分子检测指南- CAP/IASLC/AMP，2017 NCCN Guidelines, NSCLC, 2017 中国晚期原发性肺癌诊治专家共识（2016年版）- 2016 经评估不可进行手术切除的NSCLC患者，优先推荐基于血液标本的EGFR基因突变检测; 一代/二代EGFR-TKI治疗耐药进展的患者，优先推荐基于血液的EGFR基因突变（须含T790M突变）检测; 检

18、测多个平行临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐NGS pre-analytical variables规范化 analytical validity interpretation and reporting clinical validity标准化 clinical utility二、如何做？2、检测平台主要ctDNA检测技术：PCR类技术所需仪器特殊耗材灵敏度定量ARMS PCR普通PCR仪无无百分之一千分之一不能能荧光定量PCR普通PCR仪Thermo/QuantStudioTM3D数字PCR芯片十万分之一十万分之一能能ddPCRBio-rad/QX200微滴发生器、PCR buffer

19、RainDance digital PCR System芯片有百万分之一百万分之一能能BEAMing PCR特殊检测设备主要ctDNA检测技术：NGS类技术名称专利权公司技术特点平台技术优势灵敏度预扩增和标签扩增TAM-seqInivata高通量测序高通量测序灵敏度高，特异性好灵敏度高，特异性好万分之一万分之一罗氏Roche单双链接头DNA捕获技术CAPP-Seq安可济AccuraGen环化特异性引物扩增技术高通量测序ddPCRFireflycSmart环化扩增效率高万分之一万分之一贝瑞和康BerryGenomics高通量测序环化扩增环化扩增效率高灵敏度高，特异性好灵敏度高，特异性好Duple

20、xSequencingTwinStrandBioscience接头Index，链特异性高通量测序高通量测序暂无数据万分之一DigitalSequencing单双链接头UID和DNA捕获技术GuardantARMS, digital PCR, NGS 的比较ARMSDigital PCRNGS单一基因/已知突变位点单一基因/知突变位点已 多个基因/测序长短可知或未知突变位点5%(依照检检测灵敏度下限数据能否量化试验操作难度数据解读难度报告准备时间是否已批准上市1-5%0.1%可量化+测序列不同而异)半定量标准基线校正)(需有可量化+(专业实力差距大)2-3周2-3天+3-4天伴随诊断VVVV动态

21、监测V(需有标准基线校正)V临床应用新靶点探寻耐药机制探寻病人生物标记物VV单一靶点单一靶点多靶点ARMSAmplification Refractory Mutation System 扩增阻碍突变系统通过等位基因特异扩增选择性扩增目标序列，分别出突变DNA，然后通过实时荧光PCR检测是否存在突变；以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。突变ARMS引物延伸有突变产生= 有延伸= 有扩增A突变DNA模板Single3 basemismatchCommon primer突变ARMS引物不延伸野生DNA模板没有突变产生= 没有延伸= 没有扩增GCommon primerLittle S. Cu

22、rr Protoc Hum Genet 2001;Chapter 9(Unit 9.8):111ARMS法检测基本流程Step 1ctDNA的抽提、定量Step 2PCR反应体系配制、上机Step 3报告的解读、发布常见ARMS平台ADxCobasQIAGEN突变DNA链上结合有特异探针该探针含有一个荧光基团和淬灭基团Scorpion 探针检测出突变的序列双环探针杂交前部发光，与靶DNA结合后发光共同点：“引物选择靶序列阶段”“只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，野生型的不扩增不同点：荧光激发方式一代ARMS平台及特性3Roche ARMS: 敏感性: 75%, 特异性: 96%

23、1 Qiagen ARMS 敏感性65.7%，特异性: 99%2 ADx ARMS: 敏感性67.5% 特异性100%试剂盒名称是否获批用途及特点灵敏度尚未获CFDA认证Therascreen EGFR1%plasma RGQ PCR Kit血液血液CFDA和CE认证ADx-EGFR mutationin ctDNA1%5%CFDA和CE认证Cobas EGFRMutation Test v1只检测组织Mok T et al. 2015, CCR二代ARMS平台及特性Cobas EGFR Mutation Test v21One new PCR kit for both tissue and

24、plasmaT790M mutation 血液检测组织 vs 血液 : 敏感性41%，特异性: 100%2 ADx-SuperARMST790M mutation 血液检测SuperARMS vs ddPCR敏感性：92%特异性：100%一致性：97.8%ddPCRT790M in ctDNA+-Total23230+-ADx-SuperARMS2616386Total2561二代ARMS检测ctDNA T790M 突变可行，但仍需更多例证Mok T et al. 2015, CCRARMS-Plus平台建立引入与野生型DNA互补的blocker，避免高峰度野生型DNA模板造成的假阳性。掺入3

25、、10个copies突变型质粒DNA到20000个copiesgDNA中，得出该系统的检出限为0.015%。通过对134例健康对照者的检测，明确该系统的cutoff值。ARMS-Plus检测性能Comparison of ARMS-Plus and ddPCR in detecting plasma EGFR mutationsddPCR19DelL858RT790MWild-type Total19DelL858RT790MWild-typeTotal700070800800213221455091034668ARMS-Plusconcordance rate: 91.18%Correlat

26、ion of the plasma EGFR mutant abundance detected by ARMS-Plus and ddPCR19Del: R=0.7956,P0.0001L858R: R=0.7710,P0.0001Wang et al, Lung Cancer,2017,12(114):31-3719DelL858RARMS法性能验证及资格审批最低检出限：利用健康人血浆将19-Del、L858R、T790M三种突变类型质粒分别稀释至10、20、40、80和160拷贝/l，验证试剂盒的最低检出限10拷贝/l。精密度：利用健康人血浆将19-Del、L858R、T790M三种突变

27、类型质粒分别稀释至10拷贝/l，随后利用该浓度质粒进行批内和批间精密度检测。符合率：利用肺癌患者临床样本，同时使用ARMS法以及NGS进行检测，结合组织分子病理结果，进行符合率判断。2015年8月获得临检中心审批Droplet Digital PCR整体原理：“分而治之”（divide and conquer），灵敏度高，适合稀有DNA片段检测DilutionDistribution Amplification QuantificationNGSctDNA提取及质量检测文库制备及质量控制测序文库质量检测测序及数据分析NGS和ddPCR都能够报告等位基因突变频率，反映不同亚克隆的比例关系NGS和

28、ddPCR都是通过计算，看检测出多少带有突变的DNA（突变型），和检测到的所有的DNA（野生型+突变型）的比值来确定等位基因突变频率（AF）。 等位基因突变频率=4/14=28.5% 未突变的DNA来自正常组织或肿瘤中的其他亚克隆EGFR L858通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异质性有帮助。NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类 MET 14 exon skipping，HER2 20 exon insertion等情况复杂的突变 EGFR等热点基因的非热点突变位点 A

29、LK等热点基因的非常见融合方式 罕见的EGFR-19Del 可能会造成PCR方法假阴性约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合，但有1/4为与其他基因的融合，包括： STRN-ALK CATSPERB-ALK ACVR1-ALK CLIP1-ALK DPH6-AS1-ALK KIF5B-ALK RP11-320M2.1-ALK UGP2-ALKEGFR检测 -从定性到定量肿瘤异质性导致肿瘤组织中EGFR突变细胞只占一定的比例传统的定性检测仅能给出基因有无突变的信息，而无法判断肿瘤的敏感突变丰度，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断研究显示大约20%-30%的样本，DNA测序为突变阴性，而

30、ARMS-PCR法检测为弱阳性。对这部分病人是否用药仍有争论研究表明，EGFR基因的敏感突变丰度与靶向药物疗效关系密切EGFR定量检测结果可能为指导TKI用药方案更好的biomarkerZhou et al, 2011; J Clin Oncol 29:3316-3321EGFR突变类型与丰度与TKI疗效显著相关Li, X et al. J Thor Oncol 2017; 12(9):1388-97EGFR突变丰度cut-off分组后的生存分析exon 19 deletion (4.9%) (C) and L858R (9.5%) (D)exon 19 deletion (4.9%) (E)

31、 and L858R (9.5%) (F)Li, X et al. J Thor Oncol 2017; 12(9):1388-97低EGFR突变丰度的PFS与野生型接近Li, X et al. J Thor Oncol 2017; 12(9):1388-97三、如何做的准？自建系统性能确认实验室自建分子诊断项目的基本要求(2016)准确性实验室资质及环境精确性监管实验室人员要求实验室管理要求参考范围可报告范围分析灵敏度性能确认性能确认质量控制试剂耗材质量室内质控、室间质评分析特异性临床验证中国医师协会检验医师分会分子诊断专家委员会：实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识血液EGFR基因突变检

32、测流程微滴阅读结果分析生成微滴PCR扩增血浆分离（两次离心）4 1600g 10min4 16000g 10minQX200 Droplet Digital PCR 系统样本检测核酸抽提QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit（55114）PCR反应体系配置ddPCRTM Supermixfor Probes;PrimePCRTMddPCRTM MutationAssayQCQuibit 3.0分析前质量控制-样本处理方法：选择早期和晚期临床肺癌患者各3例，2h内分离血浆，每个病人血浆均分成2mL的4等份，以4个不同公司的试剂盒进行血浆游离DNA抽提，qubit比较

33、其浓度，2100检测相应的纯度。公司A公司BctDNA浓度比较公司A公司B10008006004002000公司C公司D公司C公司D不同临床分期的血浆样本早3血浆抽提2100检测cfDNA条带分布3Data and Results summaryQiaomei Guo1, Junlei Wang , Jianfeng Xiao, Lin Wang, Xiaomeng Hu, Wenjun Yu, Gang Song,Jiatao Lou and JianFeng Chen. Heterogeneous mutation pattern in tumor tissue andcirculatin

34、g tumor DNA warrants parallel NGS panel testing. Molecular Cancer (2018) 17:1313Detection rate and concordance rate analysis (cfDNA vs FFPE)Early-Stage11Advanced stage10Patients NO.Mutation detetion rate in cfDNAPositive concordance rateOverall concordance rate63.3% (7/11)44.4% (4/9)54.6% (6/11)60%

35、(6/10)71.4% (5/7)80% (8/10)3DNA damage in FFPE didnt contribute to the discordancebetween tissues and cfDNA Only 22.5% (9/40) of somatic alterations were detected in all three sample types (FF, FFPE and ctDNA) 32.5% (13/40) mutations were cfDNA specific and 40% (16/40) mutations were FFPE specific.

36、25.9% (7/27) of somatic mutations exist in the FFPE alone, 11.1% (3/27) of somatic mutations exist in the FF alone The overall concordance rate between matched FFPE sample/ctDNA and FF sample/ctDNA were 66.7% (14/21) and57.1% (12/21), respectively.3Plasma processing time affect mutation detection in

37、 cfDNA0.99可判断为线性。1 9 -D e lsL 8 5 8 RT 7 9 0 M1 0 01 01 0 01 0Y = 1.010*X - 9.999e-0051 0 01 0Y = 0.9566*X + 0.0004336Y = 1.016*X - 0.00016031110 .10 .10 .10 .0 10 .0 0 10 .0 10 .0 10 .0 0 10 .0 0 10 .0 0 10 .0 10 .111 01 0 00 .0 0 10 .0 10 .111 01 0 00 .0 0 10 .0 10 .111 01 0 0E x p e c te d m u ta

38、 n t(% )E x p e c te d m u ta n t(% )E x p e c te d m u ta n t(% )Guo qiaomei, et al, Oncotarget, in submission分析灵敏度方法：将1%突变比例的标准品采用野生型标准品依次稀释为0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度，每个位点每种突变比例下设置20个反应。要求CV%10000空白对照：水阴性对照：野生型细胞系基因组DNA质控正常弱阳性对照：突变比例0.04%基因组DNA阳性对照：突变比例0.1%基因组DNA野生型拷贝数300血液EGFR基因突变标准检测流程建立血浆分离ctDNA提取上

39、机检测结果判读复检Digital PCR在未来血检中的意义A. 目前常用方法EGFR-TKI 耐药发生T790MpositiveThird gen. EGFR-TKIChemotherapy病人进行二次组织活检 ,来检测是否有T790M突变T790MnegativeB. 建议的方法EGFR-TKI 耐药发生T790MpositiveT790M跳过二次活检, 开始第三代 EGFR-TKI治疗以政府批准的血检方法和检测平台 ，先为耐药病人进行T790M &敏感性突变的检测T790Mpositive进行二次活检，再次确认是否Third gen. EGFR-TKIChemotherapynegativ

40、e有T790M突变存在T790Mnegative血检ctDNA检测定位更加重要Oxnard G, et al. ELCC 2016; Abstract 1350_PRctDNA-NGS性能确认依据及方案确定多家技术对标公实验室资质及环境司监管实验室人员要求实验室管理要求制定详细的对比方案进行人员教育培训性能确认购买标准品收集临床样本质量控制试剂耗材质量室内质控、室间质评样本预处理上机测序准确性精确性生信分析结果比对参考范围可报告范围分析灵敏度分析特异性性能确认中国医师协会检验医师分会分子诊断专家委员会：实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识临床样本测序结果结合临床治疗情况进一步对比分析临床验证

41、Comparison Between NGS Error Correctionsa. Newman 2014, 2016b. Narayan 2012; Forshew 2012c. Lv 2015d. Xu 2017e. Wang in submissionAnalytical Validity LOD and Specificity The lung cancerpanel covers EGFR,KRAS and BRAFactionablemutations The inputs arecfDNA referencestanders including6 hotspotMol. num

42、ber of variantDNA input(ng)034.5566200%200%201020mutationsAF0.05% 0.30% 0.20% 0.10%21 21 25 2469.0% 97.6% 99.2% 96.0%Number of experimentsAvg. detec on rateAnalytical Validity Sensitivity（灵敏度）Index No.Samplesensitivity(%) Average Sensitivity Specifity(%) Average SpecifityPPV(%) Average PPV使用突变比例为0.1

43、%的标准品，在input量为20ng的前提下，在同一实验条件下并用同一批号试剂，重复测定20次，保证检出率95%。120.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD0.1%AG_STD83.310010083.310083.310010010010010010010

44、010010010010010083.383.310010010010010010010010010010010010010010010010010010010098.41001001001001001001001001001003456789101112131415161718192095.8399.9299.1710010010010010010010010010083.3* The data are based on the expected 6 true positives and expected 62 true negatives, considering the total nu

45、mber of 68 hotspots targeted by the Comet Lung cfDNA Assay.Analytical Validity Repeatability（重复性）同一个操作者用同一批样本（0.5%和0.1%）使用同一批号试剂在同一台仪器上检测，重复3天（注意：每一浓度每次做2个重复)，保证符合率90%Sensitivity(%)Specificity(%)Coincidence(%)Sample RepeatAll runsaverage Single point(n=6)All runsaverage(n=6)RunAll runsRun average(n=

46、2)Run average(n=2)SinglepointSingle pointaverage average(n=2)(n=6)10010010010010083.33100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100Day 10.1%mix Day 2Day 310010010010010010010010010097.2210010010010010010010010010010010091.67100100100100100100100Day 11000.5%mix Day 2Day 3100100100*

47、The data are based on the expected 6 true positives and expected 62 true negatives,considering the total number of 68 hotspots targeted by the Comet Lung cfDNA Assay.Analytical Validity Reproducibility（重现性）Sensitivity(%)Specificity(%)Coincidence(%)user All usersIndividualSiteSample RepeatAll usersav

48、erage(n=4)All usersaverage(n=4)Individual user averageIndividual user averageIndividuaverage average不同操作者用同一批样本（0.5%和0.1%）使用不同批号试剂在不同仪器上检测，重复3天(注意：每一浓度每次做2个重复），保证符合率90%user(n=2)user(n=2)al user(n=2)(n=4)10010010010010083.3383.3310083.3383.3310010010010010010010010010010010010010010010010010010010010

49、010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010098.598.510098.598.5100100100100100100100100100100100100100100Day 1Day 2Day 3100100100100100100100100100100100100100100100Site A User 1Site B User 2Site A User 1Site B User 210099.2599.2598.510091.6791.6783.331000.1%mix94.4510099.5

50、0Day 1Day 2Day 3Day 1Day 2Day 3Day 1Day 2Day 31001001001001001000.5%mix100100100100100100100100100*The data are based on the expected 6 true positives and expected 62 true negatives, considering the total number of 68 hotspots targeted by the Comet Lung cfDNA Assay.Analytical Validity Specificity（特异

51、性）分类模板性质检出率0%特异性100%100%100%低浓度野生型基因组DNA(cell-line10ng)中浓度野生型基因组DNA(cell-line 20ng)高浓度野生型基因组DNA(cell-line 40ng)野生型模板0%0%外源干扰物模板内源干扰物模板20ng 0.5%AG_STD+流感嗜血杆菌DNA(10ng)100%100%20ng 0.5%AG_STD+血红蛋白（溶血）20ng 0.5%AG_STD+胆红素（黄疸）20ng 0.5%AG_STD+甘油三酯（脂血）100%100%100%100%100%100%溶血血浆黄疸血浆正常血浆Clinical Validity-St

52、udy design and workflow（临床验证）Clinical Validity-Characteristics of patientsVariablePatient Count (n = 134)Age, years, median (range)62 (23-83)=70-yr old24(17.9%)110(82.1%). 70-yr oldSexFemale68(50.7%)66(49.3%)MaleTumor stageI9 (6.7%)4 (3.0%)IIIIIIVNA15 (11.2%)105 (78.4%)1 (0.7%)Patient condition at b

53、lood drawPre- treatment42 (31.3%)63 (47.0%)29 (21.6%)During treatmentPDTreated with EGFR TKI1st and 2nd generation only56 (41.8%)3rd generationNone8 (6.0%)70 (52.2%)cfDNA突变图谱与已报道的组织突变谱相似组织ARMS与cfDNA Firefly NGS检测比较分析ck CIlowerck CIhigherNumber ofComparisonMutationConcordance Sensitivity SpecificityP

54、PANPAckp valueAll Patient (n=95)19-delL858R87.4%91.6%81.1%73.1%91.4%98.6%85.7%95.0%88.3%90.7%0.7320.7720.590.6230.8730.920.7730.07719595T790M85.3%100.0%85.1%6.7%100.0%0.107-0.08730.3020.00051295G719XCombined93.0%88.7%100.0%78.5%92.9%91.3%25.0%68.9%100.0%94.5%0.3770.663-0.1550.5630.9090.7630.2480.188

55、43328Pre-treatment (n=29)19-delL858RT790MG719X89.7%89.7%100.0%100.0%94.3%83.3%80.0%100.0%100.0%83.3%91.3%94.7%100.0%100.0%96.6%71.4%88.9%100.0%100.0%83.3%95.5%90.0%100.0%100.0%96.6%0.7030.76510.3910.516111111NaNNaN129292919106111Combined0.7990.6450.954Pre-treatment Stage III, IV (n=24)19-delL858RT79

56、0MG719X91.7%95.8%100.0%100.0%96.7%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%89.5%93.8%100.0%100.0%96.0%71.4%88.9%100.0%100.0%83.3%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%0.780.90910.4950.7351111110.481NaNNaN0.248242424189011Combined0.8890.766Pre-treatment Stage III, IV (n=21) (Panel coverage difference are removed)19-del

57、L858RT790MG719X100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%100.0%111111111111111NaNNaNNaNNaNNaN2121211578Combined组织ARMS与cfDNA Firefly 差异分析 生物因素, 低肿瘤负荷 I期和II 期患者，Firefly 检出阴性的样本通过 ddPCR 进行验证 与ARMS相比Firefl