2017年初级检验技师《微生物检验》讲义第7章细菌形态学检查法

1、第 页细菌形态学检查法细菌的形态学检查是细菌检验中极为重要的基本方法之一，包括不染色标本检查法和染色标本检查法镜检可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。一、显微镜在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种：1.普通光学显微镜普通光学显微镜通常以可见光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25m，

2、而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，一般细菌大于0.25m，故用普通光学显微镜均能清楚看到。2.暗视野显微镜用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，在暗的背景中看到发亮的菌体，明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。3.相差显微镜相差显微镜依据光波穿过标本中密度不同的部位时，引起光相差异的原理，利用相差板的光栅作用，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的结构

3、呈现明、暗对比。本法可用于检查细菌的内部结构。由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。4.荧光显微镜荧光显微镜以紫外光为光源，能激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光色素染色后，置于

4、荧光显微镜下，即可激发荧光，因此在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。由于紫外光的波长较短（0.30.4m），故分辨率得到进一步提高。荧光显微镜还广泛应用于免疫荧光技术中。衣原体免疫荧光染色双球菌免疫荧光染色5.电子显微镜以电子束为光源，其波长极短（0.005nm），分辨能力大大提高，电磁圈代替普通显微镜的光学放大系统，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨1nm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。二、不染色细菌标本的检查主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的

5、方法有压滴法和悬滴法，用暗视野显微镜则效果更好。细菌如有动力。可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移；细菌如无动力，受水分子撞击细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。在临床上，有时通过不染色标本的动力检查可对某些病原菌作出初步鉴定。如疑似霍乱患者，取其水样便，制成悬滴标本，于暗视野下观察细菌动力，若见穿梭似流星状运动的细菌，同法重新制备另一标本并加入O1群霍乱弧菌诊断血清，如果原运动活泼的现象停止为制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。三、细菌染色标本的检查细菌染色标本在普通光学显微镜下可以观察细菌的形态、大小、排列、染色性、特殊结构（芽胞、荚膜、鞭毛）、异染颗粒等

6、。因为在接近中性的环境中细菌都带有负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故常用碱性染料如亚甲蓝、结晶紫、碱性复红等染色细菌。细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因此染色标本的检查在细菌的鉴定中应用最广，具非常重要的作用。细菌染色的基本程序：涂片、干燥、固定染色（媒染）（脱色）（复染）。（一）常用染料用于细菌染色的染料，本身能解离，解离后的染料可以与被染物结合生成盐类，使之着色。根据染料的带电情况，可将染料分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。1.碱性染料电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌的等电点在pH25之间，在

7、碱性、中性、弱酸性的环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的碱性染料有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。2.酸性染料电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带有负电荷故不易着色。如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。酸性染料通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。3.复合染料（中性染料）及荧光染料复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红亚甲蓝）、吉姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料如荧光素标记的抗体。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。（二）常用的染色方法在细菌感染标本的检查中，临床上常用的染色方法有革兰

8、染色、抗酸染色和荧光染色。1.单染色法用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，称为单染色法。细菌经单染色法处理后，可观察其形态、排列、大小及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。2.复染色法用两种或两种以上的染料染色的方法，称为复染色法或鉴别染色法。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。（1）革兰染色：本法是细菌学中最经典、最常用的染色方法。通过革兰染色将所有细菌分为（G+菌和G-菌）两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。革兰染色法示意革兰染色除用以鉴定细菌外，病原菌革兰染色特性可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的

9、敏感性，且其致病物质（前者产生外毒素而后者多产生内毒素）及其作用机制不同。（2）抗酸染色：抗酸染色也可将细菌分为两大类：即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。将有肺结核症状病人的痰标本，制成涂片后，作萋-纳染色镜检，根据所见结果即可报告“找到（未找到）抗酸菌”。对临床疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。（3）荧光染色：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。如痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺O法（也称金胺O-罗丹明B法）染色，以荧光显微镜检查，在暗背景中可观察到呈金黄色荧光的菌球。另外还有鞭毛染色、异染颗粒染色等。鞭毛染色后于显微镜下可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置

10、及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。疑为白喉棒状杆菌感染，进行涂片检查，除证实为革兰阳性典型棒状杆菌外，还须用异染颗粒染色法，镜检异染颗粒，方可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”，为临床早期诊断提供依据。习题检查细菌动力常用A.压滴法B.悬滴法C.毛细管法D.革兰染色法E.抗酸染色法正确答案B答案解析检查细菌动力常用悬滴法。习题革兰染色脱色时所选用乙醇浓度为A.50%B.75%C.85%D.95%E.100%正确答案D答案解析革兰染色脱色时所选用乙醇浓度为95%。习题细菌L型检查常用的染色方法为A.荚膜染色法B.芽胞染色法C.细胞壁染色法D.革兰染色法E.抗酸染色法正确答案C答案解析细菌L型检查常用的染色方法为细胞壁染色法。习题观察细菌鞭毛、芽胞常用的染色法A.墨汁染色法B.吉姆萨染色法C.特殊染色法D.革兰染色法E.抗酸染色法正确答案C答案解析观察细菌鞭毛、芽胞常用的染色法特殊染色法。习题观察细菌内部的超微结构需要采用A.荧光显微镜B.暗视野显微镜C.电子显微镜D.相差显微镜E.普通光学显微镜正确答案C答案解析观察细菌内部的