动物生物化学生物催化剂酶市公开课获奖课件

1、羧肽酶第7章 生物催化剂酶Enzymes第1页第1页本章主要内容：酶普通概念酶构成与维生素酶结构与功效关系酶催化机理酶反应动力学酶活性调整第2页第2页1.酶概述酶是由活细胞产生，能在体内或体外起同样催化作用一类含有活性中心和特殊构象生物大分子，包括蛋白质和核酸。绝大部分酶是蛋白质，尚有一些核糖核酸R N A 含有催化作用，称为核酶（ribozym e）。1.1 定义细胞代谢由成千上万化学反应构成，几乎所有反应都是由酶（enzym e）催化。酶对于动物机体生理活动有主要意义，不可或缺。酶在生产实践中有广泛应用。第3页第3页高效性酶催化作用可使反应速度比非催化反应提升108 -1020倍。比其它催

2、化反应高106 -1013倍专一性即对底物选择性或特异性。一个酶只催化一个或一类底物转变成相应产物。1.酶概述1.2 酶催化特性绝对专一性 相对专一性立体专一性第4页第4页绝对专一性一个酶只催化一个底物转变为相应产物。比如，脲酶只催化尿素水解成 CO2 和NH3。相对专一性一个酶作用于一类化合物或一类化学键。不同比如，不同蛋白水解酶对于所水解肽键两侧基团有要求。立体专一性指酶对其所催化底物立体构型有特定要求。比如，乳酸脱氢酶专一地催化 L-乳酸转变为丙酮酸，延胡索酸只作用于反式延胡索酸（反丁烯二酸）。立体专一性确保了反应定向进行。第5页第5页R1: Lys, ArgR2: 不是ProR3: T

3、yr, Trp, PheR4: 不是 Pro第6页第6页 酶容易变性这是酶化学本质（蛋白质）所决定。酶可调整性克制和激活（activation and inhibition ）反馈控制(feed back)酶原激活(activation of proenzyme)变构酶(allosteric enzyme)化学修饰(chemical modification )多酶复合体(multienzyme complex)酶在细胞中区室化 (enzyme compartmentalization )1.酶概述第7页第7页已知上千种酶绝大部分是蛋白质。单纯酶：仅由蛋白质构成酶。少数，比如：溶菌酶结合酶：除

4、蛋白质外，尚有非蛋白质成份。大多数。全酶=酶蛋白+辅助因子辅助因子包括 :十几种辅酶、辅基，尚有一些 金属离子。2. 酶构成与维生素2.1 酶化学本质第8页第8页酶蛋白作用：与特定底物结合，决定反应专一性。辅酶、辅基作用：参与电子传递、基团转移等，决定了酶所催化反应性质。辅酶与辅基都是耐热有机小分子，结构上常与维生素和核苷酸有关。辅酶与酶蛋白结合不紧，容易经透析除去，而辅基与酶蛋白共价相连。金属离子作用：它们是酶和底物联系“桥梁”；稳定酶蛋白构象；酶“活性中心”部分。2.酶构成与维生素2.1 酶化学本质第9页第9页（Vitamin）是动物和人类生理活动所必需，从食物中取得一类有机小分子。它们并

5、不是机体能量起源，也不是结构成份，大多数以辅酶、辅基形式参与调整代谢活动。A视黄醇（维生素 A脂溶性维生素：原胡萝卜素）DEK钙化醇生育酚凝血维生素2. 酶构成与维生素2.2 维生素与辅酶和辅基关系维生素第10页第10页B族维生素辅酶形式酶促反应中主要作用硫胺素素(B(B1)硫胺素焦磷酸酯酯(TPP)(TPP)-酮酸氧化脱羧酮基转移作用核黄素素(B(B2)黄素单核苷酸酸(FMN)(FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸酸(FAD)(FAD)氢原子转移氢原子转移尼克酰胺胺(PP)(PP)+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸酸(NAD(NAD )尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸+(NADP )氢原子转移氢原子转移吡哆醇醇(醛、

6、胺胺)(B6)磷酸吡哆醛氨基转移泛酸辅酶酶A(CoAA(CoA)A(CoA)酰基转移叶酸四氢叶酸一碳基团团转移生物素素(H)(H)生物素羧化作用钴胺素素(B(B12)甲基钴胺素5-脱氧腺苷钴胺素甲基转移B族维生素及其辅酶形式第11页第11页含2-60个亚基，有复杂高级结构。常通过变构效应在代谢路径中发挥主要调整作用。多酶复合体由多个功效上相关酶彼此嵌合而形成复合体。它能够促进某个阶段代谢反应高效、定向和有序地进行。串联酶或多功效酶催化相关代谢反应酶蛋白基因在进化过程中融合，使遗传信息表示后生成一条多肽链，却含有多种不同催化功效。3. 酶分子结构依据酶蛋白分子结构特点，可将其分为：单体酶只有三级

7、结构，一条多肽链酶。如 129个氨基酸溶菌酶，分子量14600。寡聚酶第12页第12页A CP蛋白构成。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶系模型3. 酶分子结构功效上相关几种酶在空间上组织在一起，定向有序地催化一系列反应。比如，丙酮酸脱氢酶系由3个酶构成，脂肪酸合成酶系由6个酶和1个第13页第13页指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接相关部位。（1）酶活性中心构成：必需基团：对酶发挥活性所必需基团。对于结合酶，辅助因子经常是活性中心构成部分。这些基团在一级结构上也许相距很远，甚至也许不在一条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，形成含有一定空间结构区域。3.酶分子结构3.1 酶活性中心第14页第14

8、页（2）酶活性中心特点不是刚性，而含有一定柔性。（约1%2%），相称于23个氨基酸残基。 活性中心在酶分子总体积中只占相称小部分 都是酶分子表面一个凹穴，有一定大小和形状，但 活性中心为非极性微环境，有助于与底物结合。活性中心。 底物与酶通过形成较弱键力次级键互相作用并结合到酶 酶与底物结合过程中，底物分子或酶分子或它们两者构象同时发生一定改变后才互相契合，这时催化基团位置也正好处于所催化底物敏感化学键部位。第15页第15页结合基团：底物在此与酶分子结合。一个酶结合部位又能够分为各种亚位点，分别与底物不同部位结合。催化基团：底物敏感键在此被打断或形成新键，从而发生一定化学反应。一个酶催化部位能

9、够不止一个。必需基团按其作用可分为：第16页第16页Substrates typically lose waters (of hydration水合作用) in the formation of the ES complex第17页第17页酶活性中心示意图活性中心是酶分子上由催化基团和结合基团构成一个微区。第18页第18页多肽链底物分子酶活性中心催化基团结合基团活性中心必需基团活性中心以外必需基团第19页第19页e），在特定条件下，通过部分肽段有限水解，转变成有活性酶。如，动物消化酶。3. 酶分子结构3.2 酶原激活无活性酶原（pr oe nz ym第20页第20页指催化相同化学反应，不过理化

10、性质不同一组酶。如，氨基酸组成、电泳行为、免疫原性、米氏常数等不同。3.3 同工酶（isozyme）3.酶分子结构以乳酸脱氢酶（LDH）为例第21页第21页LDH是1959年发觉第一个同工酶。由4个亚基构成寡聚酶，亚基分为M型和H型。因此能够装配成五种四聚体：H4(LDH1) 、 H3M(LDH2) 、 H2M2(LDH3) 、HM3(LDH4 ) 、M4(LDH5)不同LDH分布在不同组织中。比如，脊椎动物心脏中主要是 LDH1，而骨骼肌则是LDH5。第22页第22页LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)不同组织中LDH同工酶电泳图谱第23页

11、第23页化学反应是由含有一定能量活化分子互相碰撞发生。分子从初态转变为激活态所需能量称为活化能。无论何种催化剂，其作用都在于减少化学反应活化能，加快化学反应速度。4. 酶催化机理4.1 活化能第24页第24页非催化反应和酶催化反应活化能比较Ea，活化能；G，自由能改变第25页第25页S+EESP+E中间产物后人进一步发展了中间产物学说：S+EESES*EPP+E过渡态复合物4. 酶催化机理4.2 催化机理当前较满意解释是中间产物学说第26页第26页酶介入了反应过程。通过形成不稳定过渡态中间复合物，使原本一步进行反应分为两步进行，而两步反应都只需较少能量活化。从而使整个反应活化能减少。第27页第

12、27页酸碱催化：活性中心一些基团，如 His，Asp作为质子受体或供体，参与传递质子。共价催化：酶与底物形成过渡性共价中间体，限制底物活动，使反应易于进行。疏水效应：活性中心疏水区域对水分子排除、排斥，有助于酶与底物接触。4.酶催化机理在一个化学反应中，过渡态形成和活化能减少是反应进行关键环节，任何有助于过渡态形成与稳定原因都有利于酶行使其高效性。现在认为，与酶作用高效性相关主要因素有下列五个方面。邻近与定向效应： 增长了酶与底物接触机会和有效碰撞。张力效应：诱导底物变形，扭曲，增进了化学键断裂。第28页第28页4.3 锁钥学说(Lock and key Hypothesis)酶和底物结合状如

13、钥匙与锁关系。底物分子或其一部分象钥匙同样，专一地楔入到酶活性中心部位，即底物分子进行化学反应部位与酶分子活性中心含有紧密互补关系。4. 酶催化机理第29页第29页4.酶催化机理4.3 诱导契合学说（induced fit）1958年 D.E.Koshland提出酶分子活性中心结构原来并非和底物结构互相吻合，但酶活性中心是柔性而非刚性。第30页第30页当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心构象发生相应改变，其上相关各个基团达到正确排列和定向，因而使底物和酶能完全契合。当反应结束产物从酶分子上脱落下来后，酶活性中心又恢复成本来构象。第31页第31页酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响原因。反应速

14、度：单位时间内底物减少或产物增长速度，惯用初速度来衡量。5. 酶促反应动力学概念：第32页第32页影响酶促反应速度原因：反应温度pH 值酶浓度E底物浓度S克制剂I激活剂A第33页第33页最适温度（optimum T）：使酶促反应速度达到最大时温度。最适温度因不同酶而异，动物体内酶最适温度在37400C左右。酶最适温度并非酶特性性常数，它与底物、作用时间等原因相关。5.1 温度对酶促反应速度影响5. 酶促反应动力学第34页第34页酶反应温度曲线和最适温度第35页第35页5.2 溶液pH值对酶促反应速度影响5.酶促反应动力学最适pH（optimum pH）：使酶促反应速度达到最大时溶液pH。pH影

15、响酶分子解离状态。pH影响底物解离，从而影响酶与底物结合。极度pH条件引起酶蛋白变性。第36页第36页酶最适pH 普通在7 左右。也有诸多例外，如胃蛋白酶最适pH只有1.5，胰蛋白酶(7.8)。酶最适pH并非酶特性性常数，它与底物种类、浓度等原因相关。第37页第37页在其它条件拟定期，当底物浓度大大超出酶浓度时，反应速度与酶浓度成正比。5.3 酶浓度对酶促反应速度影响5.酶促反应动力学第38页第38页0.2Vm20.1例-变-S与v关系：当S很低时，S与v成百分比- 一级反应当S较高时，S与v不成百分比当S很高时，S，v不变-零级反应012345678S5.酶促反应动力学5.4 底物浓度对酶促

16、反应速度影响vVm0.3第39页第39页第40页第40页米-曼氏方程式（Michaelis-Menten equation）V=Vmax SKm + S第41页第41页米-曼氏方程解释：当SKm时，v=(Vmax/Km) S, 即v 正比于S当SKm时，v Vmax, 即S而v不变V=Vmax SKm + S第42页第42页Km意义米氏常数Km=(k2+k3)/k1Km等于酶促反应速度为最大速度二分之一时底物浓度。因此Km单位为浓度单位。Km是酶特性性常数，可表示酶与底物亲和力。在反应起始阶段，kk，mkk1平解离m越大，阐明和之间亲和力越小，复合物越不稳定。m越小，阐明和亲和力越大，复合物越

17、稳定，也越有助于反应。E +SESE + PK3K4K1K2Vmax2Vmax SKm SKm = S第43页第43页因此采用双倒数作图法：即1/v-1/S作图1V max1SKmVmax1vKm值与 Vmax值测定v-S作图法：Vmax难以测定，不能从vV/2处求得，从而造成Km也难拟定。第44页第44页1V max1SKmVmax1v第45页第45页5.5 克制剂对酶促反应速度影响5. 酶促反应动力学酶克制剂（inhibitor）:凡能使酶活性下降而不引起酶蛋白变性物质。克制作用可分为：可逆克制作用和不可逆克制作用两大类。第46页第46页（一）可逆克制作用（reversible inhib

18、ition）克制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。克制剂能够通过透析、超滤等物理办法被除去，并且能部分或所有恢复酶活性。根椐克制剂与酶结合情况，又能够分为竞争性克制、非竞争性克制等。第47页第47页1、竞争性克制作用（competitive inhibitor）一些克制剂化学结构与底物相同，与底物竞争酶活性中心并与之结合，从而减少了酶与底物结合，因而减少酶反应速度。这种作用称为竞争性克制作用。第48页第48页第49页第49页竞争性克制动力学特点是 Vmax不变，而 Km增大第50页第50页竞争性克制特点： I与S分子结构相同； Vmax 不变，Km增大； 克制程度取决于I与E亲

19、和力 ，以及I和S相对浓度百分比； 增大S可减轻或消除克制作用.第51页第51页例1：丙二酸是琥珀酸脱氢酶竞争性克制剂。这种克制作用可通过增长底物浓度而使整个反应平衡向生成产物方向移动，因而能削弱或解除这种克制作用。琥珀酸延胡索酸丙二酸第52页第52页例2：磺胺类药物抑菌作用H2NH2NCOOH对氨基苯甲酸SO2NHR磺胺类药物对氨基苯甲酸二氢喋呤啶谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸四氢叶酸第53页第53页2. 非竞争性克制 （non-competitive inhibition）一些克制剂结合在酶活性中心以外部位，因而与底物和酶结合无竞争，即底物与酶结合后还能与克制剂结合，同样克制剂

20、与酶结合后还能与底物结合。但酶分子上有了抑制剂后其催化功效基团性质发生改变，从而减少了酶活性。这种作用称为非竞争性克制作用。E +SESE + P+IEI + S+IIES第54页第54页在可逆非竞争性克制作用中：克制剂结合在活性中心以外；克制剂结合阻断了反应发生。第55页第55页非竞争性克制作用动力学特点是 Vmax变小，而 Km不变。第56页第56页非竞争性克制特点：1、I与S分子结构不同；2、Vmax 减小，Km不变；3、克制程度取决于I大小。4、这种克制作用不能用增长底物浓度办法来消除第57页第57页SHSE+ Hg2+EHg + 2H+SHSH ClSSE + As-CH=CHClE

21、As-CH=CHCl + 2HClSSH Cl巯基酶路易士气(二)不可逆克制（irreversible inhibition ）克制剂与酶必需基团以牢固共价键结合,不能用透析超滤等物理办法除去克制剂使酶恢复活性。例1： 巯基酶克制第58页第58页EHg +SSCOONaCHSHCHSHCOONaSHCHSE + HgCHSSHCOONaCOONa二巯基丁二酸钠SCH2OHSHCH2OHE + CHS As-CH=CHClSH CH2SE As-CH=CHCl + CHSHS CH2SH二巯基丙醇解毒办法：第59页第59页可使-OH磷酯化，因此它是活性中心有Ser残基酶克制剂。常见有机磷农药，如

22、敌敌畏、敌百虫，它们杀灭昆虫机理就在于可克制乙酰胆碱酯酶活性，该酶作用是将神经递质乙酰胆碱水解，若它被克制，会造成乙酰胆碱积累，使神通过度兴奋，引起昆虫神经系统功效失调而中毒致死。例2： 羟基酶克制第60页第60页金属离子： Mg 2+ 、 K+、 Mn2+阴离子：有机物：Cl-胆汁酸盐2、分类：必需激活剂非必需激活剂Mg 2+ 对己糖激酶Cl- 对淀粉酶5.酶促反应动力学5.6 激活剂对酶促反应速度影响1、激活剂: 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增长物质。如：第61页第61页6. 酶活性调整主要调整方式:酶活性调整变构调整共价修饰调整酶含量调整第62页第62页6.1 变构调整概念：变构

23、调整：生物体内一些代谢物可与酶分子调节部位进行非共价可逆性结合，改变酶分子构象，从而改变酶活性。 变构酶：受变构调整酶。 变构剂：造成变构效应代谢物。 催化部位： 调整部位：第63页第63页The three-dimensional subunit architecture of the regulatory enzymeaspartatetranscarbamoylase; two different views. This allosteric regulatory enzyme has twocatalytic clusters, each with three catalytic po

24、lypeptide chains, and three regulatoryclusters, each with two regulatory polypeptide chains. The catalytic polypeptides ineach cluster are shown in shades of blue and purple. Binding sites forallostericmodulators are found on the regulatory subunits (shown in white and red).Modulator binding produce

25、s large changes in enzyme conformation and activity.第64页第64页变构酶模型米氏双曲线与 S形变构曲线6. 酶活性调整0.11第65页第65页ATP、柠檬酸（）AMP、ADP2,6-二磷酸果糖1,6-二磷酸果糖(+)6-磷酸果糖激酶-1变构调整第66页第66页生理意义：变构酶有特性性S形动力学曲线。变构剂或底物浓度，在一定范围里，一个比较小改变就会造成反应速度明显改变，因此更具可调整性。变构酶通常是关键酶，催化代谢路径中非平衡反应，或称不可逆反应。这些酶普通处于路径开始阶段或分支点上，通过反馈控制来调整。第67页第67页6. 酶活性调整6.

26、2 共价修饰调整酶共价修饰调整：概念：酶蛋白分子上一些氨基酸残基基团，在另一组酶催化下发生可逆共价修饰，从而改变酶活性。常见修饰方式：磷酸化和去磷酸化第68页第68页EATPADPPH2O蛋白激酶磷蛋白磷酸酶肌肉中磷酸化酶磷酸化和去磷酸化过程：E磷酸化酶-bP磷酸化酶-a无活性有活性第69页第69页7. 酶命名与分类7.1 酶命名(1)习惯命名：由发觉者命名，常以底物名、反应性质以及酶起源命名；(2)系统命名（1961年国际酶学委员会拟定）每一个酶由下列三种表示：1、系统名称：底物名+反应性质2、分类编号：E.C.+四个数字3、推荐名：选一个习惯名（实用、简朴）第70页第70页1961年酶学委

27、员会（Enzyme Commission ，EC）要求酶表示法：EC. X. X. X. X比如： 乳酸脱氢酶第71页第71页7.2 酶分类氧化还原酶AH2+BA+BH2 转移酶 水解酶 裂解酶 异构酶 合成酶Ax+CAB+H2OAAA+BA+CxAH+BOHB+CBC， 需要ATP第72页第72页P OHOOHN 3 2 N HVB1，硫胺素经焦磷酸化转变为TPP，焦磷酸硫胺素。它是酮酸脱氢酶辅酶。以VB2，核黄素为基础形成两种辅基FMN黄素单核苷酸 和FAD黄素 腺嘌呤二核苷酸。作用是传递氢和电子。SC H3NC H3NOOHHOOP硫胺素焦磷酸硫胺素TPPN+H H 2N87965N14

28、ON10OHOHNOHN5OHNONNNNNH 2OOHOHP OOO -O P OOO -FMNFADH10R2e- +2H +O N2 e-+2H +第73页第73页NNNNH2NOOHOHOO P O P OOHOOOH OHNNH 2OHOHO P OONAD +NADP +尼克酸，烟酸（维生素 Vpp）NAD+/NADH ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （氧化/还原）NADP+/NADPH ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化/还原）。烟酰胺衍生物 ，传递氢和电子，氧化还原酶辅酶。NNH2ORHH2e- +H +2e- +H +第74页第74页O OH泛酸（维生素 B3） 是CoA（辅酶A ）构成成份。Co