高产淀粉酶菌株的分离鉴定

1、高产淀粉酶菌株的分离鉴定第1页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四实验目的掌握土壤样品中，微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方法。掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。第2页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 实验原理鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种变化可将该种微生物与其他微生物区分开来。第3页，共13

2、页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 实验材料及器材 锥形瓶、移液管、试管、接种环、涂布棒、培养皿、天平、灭菌锅、培养箱、摇床、离心机等第4页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 菌源及培养基菌源：选择含淀粉丰富的土壤为最佳。培养基：平板筛选培养基: 可溶性淀粉2 % 、蛋白胨1 % 、NaCl 0 .5 % 、牛肉膏 0 .5 % 、琼脂粉1.52% 、121度灭菌20分钟.分离培养基液体培养基：采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中， pH调至7.2，121灭菌15m

3、in。 第5页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 实验步骤样品稀释：称取土壤样品1g溶于9mL 无菌水中 ,或水样品 5mL 溶于45mL无菌水中 ,分别用无菌水梯度稀释至 1 10 7倍。分离：取 1 10 5、1 106 、1 107 稀释液涂布于平板筛选培养基表面，37培养72h。等长出菌落后，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。 初步筛选：将检测试剂（路戈氏碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号，以便进行下一步的复筛。 培养离心：在初筛中分离到的产淀粉酶的菌株活化后接入装有分离培养基液体培养基的三角瓶中，对其于30摇床

4、进行发酵培养48h，对发酵液8000rpm离心5min，取上清液。再次筛选：在检测培养基上面打孔后，将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置8h后取出,把路戈氏碘液加入到平板中，涂布均匀，水解圈大的其发酵液上清中的淀粉酶的活性就高，取活性最高的菌株作为目的菌株，对其进行培养,即得到高产淀粉酶的菌株。 第6页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 形态观察高产淀粉酶的菌一般为芽孢杆菌对其形态观察：菌落较大 ,中央有皱褶,圆形、规则、无光泽、灰白色 ,不透明。显微镜观察菌体特征:杆状 ,直或接近直 ,多数运动 ,有侧生鞭毛 ,芽孢中生 ,椭圆形。第7页，共13页，2022年，5月20

5、日，19点17分，星期四 注意事项要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。观察结果时要注意滴加药量和反应时间。严格无菌操作，防止污染情况的发生。分离菌株时，稀释度不够导致水解圈粘连。第8页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 结果与讨论1 稀释度对土壤细菌菌落形成的影响 用营养琼脂培养基分别培养不同稀释度的土壤菌悬液，结果表明（图1） ，10-2 10-3 10-4 10-5 10-6稀释度中形成的菌落数分别为240 124 51 33 25，其相差的倍数分别为1.9 2.4 1.5 1.3，即不同菌悬液稀释度之间没有严格的比例关系，其原因可能是操作不当和本实验的精确

6、度本来就不高。第9页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四2 土壤中有淀粉酶活性细菌的比例 为了了解土壤中含淀粉酶菌株的比例，选择了营养琼脂培养基培养基由于淀粉培养基中只有淀粉为唯一碳源，因此，在该培养基中能生长良好的细菌一般均具淀粉酶活性。试验的结果如表1所示，按照10-2,10-3,10-4,10-5,10-6 稀释度中的菌落数计算，所采集土壤样品中具淀粉酶活性的细菌比例在1:2.5 1:2.2 1:1.3 1:1.6 1:2.2 。第10页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四3 菌悬液加热处理对淀粉酶活性细菌比例的影响将菌悬液进行加热100处理，然后

7、按常规方法作稀释和培养，结果表明：加热可显著降低菌悬液中的细菌数量，但具有淀粉酶活性的细菌比例由52提高到74，加热处理可显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例说明淀粉酶活性细菌的最适生长温度比其他细菌的最适生长温度高，过高的温度抑制了其他细菌的生长。第11页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四4 淀粉酶活性细菌的获得与初步筛选 将在淀粉培养基中生长的细菌菌落分别进行进一步的划线分离，挑取单个生长的菌落接种到试管中保存，然后在含淀粉培养基的培养皿中加入碘液，观察透明圈的大小，初步选定透明圈较大的细菌菌落为淀粉酶活性较高的菌株。第12页，共13页，2022年，5月20日，19点17分，星期四 结论 通过本次试验我们了解到菌悬液稀释度对土壤细菌菌