分子标记及其在植物遗传育种中的应用

分子子标标记记及及其其在在植植物物遗遗传传育育种种中中的的应应用用遗传传标标记记（geneticmarker）具有有多多型型性性易于于鉴鉴别别与目目标标基基因因紧紧密密连连锁锁性状状标标记记色泽泽，，形形态态…细胞胞学学标标记记倒位位，，易易位位，，G/N/C带…生化化标标记记同功功酶酶…分子子标标记记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP…………基础础-基因因表表达达结果果表现现型型DNA碱基基序列列变变异异形态态标标记记遗传传学学上上稳稳定定、、可可见见的的外外部部特特征征---遗传传与与环环境境、、结结构构基基因因与与调调控控基基因因综综合合作作用用的的结结果果。。如穗穗形形、、芒芒长长、、穗穗长长、、粒粒色色、、穗穗形形、、矮矮秆秆、、卷卷叶叶等等。。特点点：：直直观观简简单单从基基因因型型到到表表现现型型存存在在基基因因表表达达、、调调控控、、个个体体发发育育等等环环节节，，表表型型差差异异有有时时难难以以反反映映基基因因型型差差异异。。细胞胞学学标标记记染色色体体数数目目变变异异及及结结构构变变异异，，表表现现在在染染色色体体核核型型（（数数目目、、大大小小、、随随体体、、着着丝丝点点位位置置等等））和和带带型型（（C带、、N带、、G带等等））。。随着分分带、、细胞胞原位位杂交交等研研究技技术的的发展展，可可在染染色体体水平平揭示示更多多遗传传变异异。特点：：直观观、快快速而而经济济，但但变异异十分分有限限，当当染色色体数数目形形态相相似时时难以以分辨辨。生化标标记——贮贮藏蛋蛋白和和同工工酶贮藏蛋蛋白同工酶酶特点：：经济济、方方便、、成本本较低低结构基基因表表达产产物，，对非非结构构基因因无能能为力力；所所检测测位点点只是是基因因组一一部分分；数数量有有限，，有时时受发发育时时期和和环境境影响响。分子标标记本质是是以核核苷酸酸序列列作为为标记记，一一般特特点：：（1））不受受季节节、环环境、、基因因表达达与否否的限限制；；（2））多态态性高高，存存在着着丰富富的等等位变变异；；（3））数量量丰富富，多多态性性遍及及整个个基因因组；；（4））表现现为““中性性”，，不影影响目目标性性状的的表达达，与与不良良性状状无必必然的的连锁锁；（5））许多多分子子标记记表现现共显显性，，能鉴鉴别纯纯合杂杂合基基因型型，提提供完完整的的信息息。分子标标记的的分类类（Staub等1996）分子标记以Southern为基础如RFLP以PCR为基础单引物PCR标记有RAPD、

AP-PCR、DAF、ISSR等双引物选择性扩增PCR主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记 如SSR、STS等植物遗遗传研研究中中常用用的分分子标标记RFLP——RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD——RandomAmplifiedPolymorphicDNAs(DAF,AP-PCR)SSR——SimpleSequenceRepeatAFLP——AmplifiedFragmentLengthPolymorphismRFLP原理：：DNA限制性性内切切酶酶酶切电泳转移到到硝酸酸纤维维素滤滤膜同位素素或非非放射射标记记（如如地高高辛等等）的的探针针杂交交胶片放放射自自显影影，显显示酶酶切片片段大大小酶切：：3-5ugDNA，以10U内切酶酶酶切切5小时电泳：：0.6-0.8%琼脂糖糖胶70V电泳16小小时染色：：EtBr染色20分钟变性：：0.25MHCl20分钟，，抽真真空，，水冼冼印迹：：加入入0.4NNaOH，进行Southern印迹冲洗：：以2×SSC冼胶，，风干干酶切——电泳泳—印印迹—杂交—洗脱预杂交交：将将杂交交膜放放人预预杂交交液（（水、、5××HSB、DenhardtⅢⅢ）中，封封好好后置置65℃温温箱中中振荡荡5－－6小小时。。杂交：：预杂杂交液液中加加入标标记好好的marker和探针针，放放入杂杂交膜膜浸匀匀。封封好杂杂交盒盒后，，置65℃℃温箱箱中振振荡过过夜。。洗脱：：将膜膜转入入洗脱脱盒，，加入入洗脱脱液65℃℃振振荡洗洗脱两两次（（15min/次），吸干包包好。。—放射自自显影影将洗脱脱好的的杂交交膜置置于增增感屏屏上,于于暗室室中将将X-光片放放于杂杂交膜膜上，，再再放上上另一一张增增感屏屏，装装人暗暗袋，，并用用夹板板夹好好。置置-70℃℃超低低温冰冰箱中中曝光光10天左左右。。使用磷磷屏仪仪，操操作更更方便便。RFLP探针探针标标记——随机引引物法法25ng变性DNA5ul寡聚核核苷酸酸2ulBSA3ul[α-32P]dCTP2ulKlenow酶加水至至50ul，，37℃℃温箱箱中标标记2小时时RFLP标记特点共显性性，可可以区区别纯纯合和和杂合合基因因型稳定、、重复复性强强某些植植物中中开发发探针针已遍遍及整整个基基因组组缺点：：DNA需要量量较大大，技技术复复杂；；用于做做图较较费时时，难难以分分析大大量样样品；在基因因组较较大、、严格格自花花授粉粉作物物上多多态性性很低低，使使遗传传图饱饱和度度低。。RAPD原理：：用一个个随机机引物物（8-10bp））、碱基随随机排排列的的寡核核苷酸酸序列列，非非定点点地扩扩增基基因组组DNA，然后电电泳分分开扩扩增片片段。。PolymeraseChainReaction-PCR3'5'5'3'TargetDNAsequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature@95˚C5'3'3'5'GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCannealprimers@60˚CTaqpolymerasebinds3’andextendsGCTCGC5'3'3'5'AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNAisdoubledwitheachcycleRepeat25-40timesRAPD的操作作PCR反应：：DNA（20ng/µl）1µµlPrimer15ng10××Buffer2.0µµlMg2+（25mM）1.2µlTaq酶（5U/µµl））0.15µµldNTP（（25mM）0.2µµl加水至至20µl，再加入入石腊腊油，，进行行PCR扩增Step195℃℃2分钟Step295℃℃15秒Step336℃℃30秒Step472℃℃45秒Step5GOTOStep246循环Step672℃5分钟PCR扩增：主要特点点无需杂交交，设计计引物也也无须知知道序列列信息；；DNA需要量少少，引物物便宜，，成本较较低；技术简便便，操作作方便、、快速，，不涉及及分子杂杂交和放放射性自自显影等等技术。。不同物种种间引物物通用；；缺点：大大多显性性遗传，，不能鉴鉴别杂合合和纯合合子；实实验重复复性较差差，结果果可靠性性较低。。DAF(DNAamplificationfingerprinting)：与RAPD不同的是是:引物浓度度更高，，引物长长度更短短（一般般5－8个碱基基），且且往往用用聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳，通常常会产生生非常复复杂的带带型，谱谱带信息息比RAPDs大得多。。（Caetano-Anolles等，1990））AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)引物较长长（10～50bp）；引物浓度度较高；；引物长度度不定，，并且常常常来自自为其它它目的而而设计的的引物（（如M13通用测序序引物））。ISSR共同优点点：在不需要要知道所所扩增DNA序列情况况下，产产生DNA片段的指指纹；需DNA量少，产产生多态态性丰富富。缺点：对反应条条件非常常敏感，，重复性性差。SCARs（SequencedCharacterizedAmplifiedRegions））为提高RAPD标记稳定定性，把把目标RAPD片段克隆隆测序，，根据片片段两末末端的序序列设计计特定引引物（通通常24个碱基基），再再进行PCR扩增，可可把相应应的单一一位点鉴鉴定出来来。具有更高高的可重重复性共显性微卫星标标记(SSR)真核生物物基因组组普遍存存在，呈呈随机分分布,大约每隔隔10-50kb就存在一一个SSR.哺乳动物物中约为为植物的的5-6倍;植物中平平均23.3kb有一个SSR;双子叶植植物SSR数量大于于单子叶叶植物,核DNASSR数量多于于细胞质质DNA;根据核心心序列碱碱基数的的不同,可分为单单碱基、、2碱基、3碱基、4碱基等多多种重复复型。不同物种其重重复序列及重重复单位频率率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基基种类不同的的SSR,丰度差别很大大。SSR的分布特点SSR的功能长期以来一直直认为SSR是转录哑区，，没有明确的的生理功能。。但随着研究究深入，证明明并非如此。。SSR的主要功能:编码氨基酸；；染色体末端的的SSR，有保护DNA完整性、避免免降解、融合合及丢失的功功能；提高或降低临临近基因转录录速率；基因重组的热热点，是基因因变异的来源源；部分SSR可产生转录启启动复合物或或活化染色体体两端序列多是是保守的单拷拷贝序列，可可以根据两端端序列设计一一对特异引物物，通过PCR将其间微卫星星序列扩增出出来，利用电电泳技术获得得长度多态性性。不同材料重复复次数的不同同，导致了SSR长度的高度变变异性。SSR分析SSR分子标记的创创制基因组文库的的构建探针制备-预预杂交-带有有SSR克隆的选择测序引物设计检测其它方法:EST-SSR、相关种间SSR......Cross-speciesSSRTaxonomicTransferability PolymorphismDivergence%(N)%(N)Samesubgenus89.8(521)78.3(299)Samegenus76.4(1800)86.0(773)Samealliance45.4(403)50.4(141)Samefamily 35.2(1683)58.4(363)SSR的操作PCR反应：DNA（20ng/µl） 4µµlPrimer（1mM）） 0.25µl10×Buffer2.0µµlMg2+（25mM）） 1.2µlTaq酶（5U/µl）0.1µµldNTP（25mM）0.2µµl加水至20µµl混合后，进行行PCR扩增：Step195℃2分钟Step295℃30秒Step356℃30秒Step472℃60秒Step5GOTOStep231循环注：SSR引物退火温度度在52-65℃不等。SSR的特点：两侧顺序保守守，在同种间间多相同；数量丰富，在在整个基因组组均匀随机分分布；实验重复性好好，结果可靠靠；多数SSR增减重复序列列频率高，在在品种间具广广泛位点变异异；共显性标记，，可鉴别杂合合子和纯合子子；仅需微量组织织，适合PCR分析半自动化化相对的物种专专一性；由于开发时需需针对每个座座位的微卫星星序列，发现现其两端的单单拷贝序列设设计引物，需需建立基因文文库、克隆识识别与筛选、、测序等过程程，开发困难难，费用较高高，耗时长；；实际分析时一一般每次只分分析单个位点点；不同引物退火火温度不同，，需要探索。。不足：SSR的检测琼脂糖凝胶检检测（同前））聚丙烯酰胺凝凝胶检测一般采用银染染、荧光检测测。银染检测程程序脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟冲洗：用重蒸水水冲洗胶板板2次，每每次5分钟钟染色：加染色液液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟冲洗：用重蒸水水冲洗胶板板不超过5秒钟；显影：预冷显影影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹纹出现；定影：在固定/停止液并并轻摇3-5分钟；；冲洗：用重蒸水水冲洗2次次，每次2分钟；干胶：室温下自自然干燥过过夜。AFLP（（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)原理：基于RFLP技术和PCR技术的结合合DNAMseI-MseIMseI-EcoRIEcoRI-EcoRIMseI-MseI片段环化，，不利小片片段扩增；；EcoRI-EcoRI引物的退火火温度高；；MseI-EcoRI片段优先扩扩增酶切连接接头序列MseⅠ接头、PstⅠ分别为：MseⅠ：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’3’-TACTCAGGACTCAT-5’PstⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’’EcoRⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’’M00:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'；P00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';E00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';MseI-primers+3:5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3‘EcoRI-primers+3:5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3‘PstI-primers+3:5'-GACTGCGTACATCGAGNNN-3‘AFLP技术的特点点（1）由于于内切酶及及选择性碱碱基组合数数和种类很很多，产生生标记数无无限，可覆覆盖整个基基因组。（2）多态态性远远超超过其它分分子标记，，一般可检检测到50-100个AFLP扩增产物，，能够在遗遗传关系十十分相近的的材料产生生多态性，，被认为是是指纹图谱谱技术中多多态性最丰丰富的一项项技术。（3）AFLP分析由于扩扩增片段较较短（30-700bp)，分辨率高。。（4）AFLP分析用样量量少（0.05-0.5gDNA），而且对模板板浓度的变变化不敏感感。（5）由于于特定引物物扩增，退退火温度高高，因而假假阳性低，，可靠性高高。（6）引物物在不同物物种间是通通用的，可可用于没有有任何分子子生物学研研究基础的的物种。（7）银染染技术具有有快速、方方便的特点点，在1-2天内可可以得到指指纹。AFLP操作具体包包括三个步步骤：1.酶切--连连接；2.PCR扩增，使目目的序列扩扩增到0.5～1μg；3.电泳分离（（利用聚丙丙烯酰胺凝凝胶）。对于基因组组较大的物物种，需要要进行两步步扩增—预预扩增和选选择性扩增增。AFLP操作步骤：：模板DNA的酶切与连连接DNA（200ng/µl））2.5µlMseⅠ3单位位PstⅠ3单位位MseⅠ接头头（（50pmol/µµl））1.0µµlPstⅠ接头头（（5pmol/µµl））1.0µµl10××NEBBuffer2.5µµl100××BSA0.25µµlATP（（10mM））2.0µµlT4-连接接酶酶（（3U/µµl））0.4µµl加水水至至25µµl，，37℃℃酶切切-连连接接4-6小小时时，，或或过过夜夜。AFLP实验验程程序序DNA片段段的的预预扩扩增增取2.0µµl完成成的的样样品品，，加加入入18µµl如下下混混合合液液：：MseⅠ引物物（（M00，，50ng/µµl））0.6µµlPstⅠ引物物（（P00，，50ng/µµl））0.6µµl10××PCRBuffer2.0µµlMg2+（25mM））1.2µµlTaq酶（（5U/µµl））0.1µµldNTP（（25mM））0.16µµl加ddH2O至20µµl混合合后后，，在在如如下下PCR条件件下下扩扩增增：：Step195℃℃2分钟钟Step295℃℃30秒Step356℃℃30秒Step472℃℃60秒Step5GOTOStep231cyclesStep672℃℃5分钟钟AFLP的选选择择性性扩扩增增取4µµl稀释释预预扩扩增增液液，，加加入入16µµl如下下反反应应液液：：PstⅠ引物（50ng/µµl）0.8µlMseⅠ引物（50ng/µµl）0.8µl10×PCRBuffer2.0µµlMg2+（30mM）1.1µldNTP（25mM））0.18µlTaq酶（5U/µl）0.12µlddH2O11.0µl混合后按按如下PCR程序扩增增：Step195℃2分钟Step295℃30秒Step365℃30秒（-0.7℃℃/cycle）Step472℃60秒Step5GOTOStep212循环Step695℃30秒Step756℃30秒Step872℃60秒Step9GOTOStep630cyclesStep1072℃5分钟AFLP的检测银染荧光同位素检检测注意事项项：1．AFLP酶切反应应对模板板DNA质量要求求较高，，要求260/280在1.8左左右，且且不能有有降解。。2．AFLP反应对模模板DNA浓度不是是很敏感感，在50pg-50ng时，均可可以观察察到多态态性带，，但为了了实验的的准确性性，DNA浓度不能能太低。。3．酶切切-连接接反应可可以分开开作，也也可以合合在一起起作，但但合在一一起更方方便些。。4．AFLP反应对PCR要求较高高，要首首先摸索索优化Mg2+、dNTP条件，达达到最佳佳扩增。。5．EcoRⅠ受甲基化化胞嘧啶啶的影响响较小，，而PstⅠ对富含的的甲基化化胞嘧啶啶十分敏敏感，因因而PstⅠ-MseⅠ检测的多多为表达达区域，，而EcoRⅠ-MseⅠ检测位点点聚集在在甲基化化较高的的重复序序列区域域。6．引物物中用作作选择性性核苷酸酸的Ｇ和和Ｃ含量量对扩增增出的产产物数目目有影响响。一般般而言，，Ｇ和ＣＣ含量越越高，扩扩增出的的产物数数目越少少。7．同位位素、、荧光光标记记分辨辨率较较高，，但价价格昂昂贵，，操作作不方方便；；银染染方法法方便便快捷捷，掌掌握好好各个个环节节，同同样可可以达达到很很好的的效果果。为什么么用双双酶解解?适合PCR扩增效效率与与变性性胶的的分辨辨率减少PCR扩增的的片段段,从而减减少使使用选选择性性碱基基的数数目使标记记单链链成为为可能能增加PCR扩增的的灵活活性增加使使用引引物的的灵活活性为什么么要预预扩增增?减少选选择性性碱基基的错错配减轻背背景提供足足量模模板DNA降低模模板浓浓度的的影响响目的：：分子标标记辅辅助选选择(MAS)筛选BAC文库，，进行行图位位克隆隆（map-basedgenecloning）AFLPSCARPIC/Simpson遗传多样性系数=1-Pi2等位基因数目A

A=4PIC=1–SUM(0.47)2+(0.30)2+(0.17)2+(0.04)2=0.64SSR资料：遗传相相似系系数Gower(1985):

a+da+b+c+d简单匹配系数（SM）(Simplematchingcoefficient)

aa+b+cJaccard相似系数(Jaccard1908).

2a2a+b+cDice(1945)相似系数，即Nei&Li(1979)相似系数.其中:abcd+

-+-kj遗传距距离的的计算算：Rogers（1972）Rogers-W（RogersdistanceasmodifiedbyWright（1978）两个随随机机群体体j、、k间的遗遗传距距离（（Nei1972））:Xij为X群体第第i个位点点第j个等位位基因因频率率Yij为Y群体第第i个位点点第j个位点点基因因频率率在种质质资源源研究究中，，大多多数采采用罗罗杰斯斯距离离（RD）和改改良的的罗杰杰斯距距离（（MRD）（Rogers，1972；Goodman&Stuber，1983）。根据遗遗传特特性确确定的的罗杰杰斯距距离在在相关关种质质的亲亲缘关关系分分析中中非常常有用用；而而改良良的罗罗杰斯斯距离离还适适用于于杂种种优势势研究究。聚类分分析聚类指指标：：遗传相相似系系数遗传距离离聚类方法法：SAHN（SequentialAgglomerativeHierarchicalandNested））clustering常用UPGMA分析软件件：NTSYS-pc2.02（（Rholf，，1998）QTL分析‘A’HomozygotefortheallelefromAparent‘B’HomozygotefortheallelefromBparent‘H’HeterozygotecarryingbothalellesAandB‘C’EitherBBorABgenotype‘D’EitherAAorABgenotype‘-’MissingdatafortheindividualatthislocusdatatypeF2intercross2051*locus1BBBHH-AAABBBHHH-AABA*locus2AB-ABHABHAB-AB-ABHAH*locus3ABBAHHHBHABHABHBBHH-#Locus3maybemis-scoredinindividual12!*locus4ABHHABAAAHAB-ABHABHH*locus5ABHABHAA-ABHABHAHHHB*trait16.37.78.06.24.18.86.55.47.38.79.0-6.87.27.17.68.38.17.56.8EST(ExpressedSequenceTags)SNP（singlenucleotidepolymophism）cSSR、cSNPDNA微阵列（Microarray））蛋白质组学．．．．．．．新型分子标记记EST是长约150-400bp的基因表达序序列片段，携携带着完整基基因的某些片片段。mRNA反转录成cDNA，克隆到质粒或或噬菌体载体体，构建cDNA文库，而后大大规模随机挑挑选克隆，对对5’或3’’端进行一步步法测序，获获得对生长发发育、遗传变变异、衰老死死亡等过程认认识的技术。。EST(ExpressedSequenceTags)DNADatabankscDNAresourcesGenbank(NCBI),NucleotideSequenceDatabase(EMBL),DDBJ,MGC,…GenomicDNAresourcesHTG,dbGSS,GOLD,ERGO,…ESTresourcesdbEST,UniGene,GIs,STACKS,DOTS,…OthersdbSTS,UniSTS,dbSNP,TransFac,ISIS,Repbase,......常用基因组网网址：单核苷酸多态态（SNP-singlenucleotidepolymophism））SNP是由于单个核核苷酸改变而而导致的核酸酸序列多态，，即基因中的的点突变。特特点：双等位基因在基因组中的的发生频率比比较高有些SNP位点还影响基基因的功能SNPs可大大丰富既既有的连锁图图成熟自动化技技术，有望分分析成千上万万的SNPscSSR、cSNP———从EST中开发SSR、SNP目前某些植物物全序列的测测定及EST数据库的开发发，为SSR、SNP的开发开辟了了新的途径。优点：表达序列，与与特定功能有有联系多态性丰富，，可大大丰富富标记数目开发简单、经经济利用DNA芯片技术，将将大量探针固固定于玻/硅硅片上，然后后用荧光标记记样品进行大大量分子杂交交，以比较不不同组织或器器官的基因表表达水平，筛筛选突变基因因，分析基因因表达模式。。优优点：密度度高、制作方方便，解决了了传统核酸杂杂交技术复杂杂、自动化程程度低、检测测目的分子数数量少、低通通量等不足DNA微阵列（Microarray））微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可可比性微量化—降低待检样品品用量自动化—提高工作效率率低成本—可迅速普及推推广生物芯片的特特征与优点蛋白质组学为为基础的分子子标记蛋白质是基因因表达的产物物,是基因功能的的执行体，决决定了生物的的生长、发育育、繁殖等各各种性状。蛋白质组研究究---了解生生物体体蛋白白质表表达的的时空空分布布规律律,不同个个体/组织间间的表表达差差异蛋白白质质分分子子标标记记---定位位生生物物的的表表性性变变异异(如抗抗病病、、抗抗逆逆等等性性状状)和相相关关基基因因Thekeytechniqueinvolvesinproteomics1.Massspectrometry2.Two-dimensionalgelelectrophoresis3.Yeasttwo-hybridsystem分子子标标记记技技术术在植植物物遗遗传传研研究究中中的的应应用用利用用遗遗传传图图和和遗遗传传标标记记可可用用来来加加速速植植物物育育种种进进程程。。经典典遗遗传传图图谱谱：：形形态态、、生生理理和和生生化化标标记记，，数数量量极极为为有有限限，，图图谱谱分分辨辨率率大大都都很很低低，，表表现现标标记记少少，，图图距距大大，，饱饱和和度度低低。。分子子标标记记技技术术的的发发展展，，使使图图谱谱上上标标记记的的密密度度越越来来越越高高。。植物物基基因因组组遗遗传传作作图图构建建遗遗传传图图谱谱（molecularmarkerlinkagemap）以具具有有遗遗传传多多型型性性的的分分子子标标记记为为““路路标标””Polymorphicmolecularmarkeras““routesign””以减减数数分分裂裂中中发发生生的的遗遗传传重重组组交交换换值值为为图图距距Recombinationfrequency(%)inmeiosisas““mapdistance(cM)””绘制制高高密密度度的的分分子子标标记记连连锁锁图图GeneticlinkagemapwithhighdensityQTL作图所需需的数据据遗传标记记数据数量性状状数据分子标记记连锁图图谱的构构建定位群体体亲本间间多态性性分子标标记的筛筛选定位群体体的组建建定位群体体分子标标记分析析分子标记记连锁图图谱的绘绘制利用3个个分离群群体，一一个人，，三个月月时间，，能完成成包括1032个AFLP标记的遗遗传连锁锁图谱（（Faye等1995）。。AFLP不仅能缩缩小抗病病基因与与连锁标标记之间间的距离离，而且且在RFLP遗传图上上，可增增加染色色体末端端标记和和填充RFLP空隙，不不干扰RFLP标记簇，，从而大大大增加加了遗传传图的饱饱和度。。在植物遗遗传多样样性研究究上的应应用对植物种种质资源源遗传多多样性的的全面了了解，对对于拓宽宽遗传基基础的育育种策略略十分重重要。eg.贾继增等等（1997））利用21条染染色体上上473个RFLP探针对小小麦遗传传多样性性分析发发现，小小麦不同同位点、、不同染染色体上上的遗传传多样性性各不相相同，普普通小麦麦B基因组遗遗传多样样性较高高，其中中尤以2B、6B、7B更高，而而D组的遗传传多样性性最差。。对在小小麦育种种中引进进新的遗遗传变异异具有一一定的意意义。eg.通过288个位位点上对对338个一粒粒小麦系系群AFLP指纹分析析，结合合种系分分析，发发现来源源于土耳耳其东南部Karacadag山脉的一一个野生生一粒小小麦（T.boeoticum）群体与栽栽培一粒粒小麦（（T.monococcum）遗传上最最为相近近，从而而推断该该地区为为现代栽栽培一粒粒小麦的的发源地地（Heun等1998）。。植物起源源、分类类和进化化研究品种的DNA指纹图谱谱定义：能能够鉴定定作物品品种之间间差异的的电泳图图谱。特特点：高度的个个体特异异性、环环境的稳稳定性及及丰富的的多态性性。用途：鉴鉴定品种种真实性性和纯度度，用于于新品种种登记和和品种知知识产权权保护等等。其中中AFLP被推荐为为指纹图图谱绘制制的最佳佳方法之之一。eg.Law等（1998））利用6个AFLP引物组合合产生90多条条多态性性条带，，建立了了英国1934-1994广广泛种植植的55份小麦麦的指纹纹图谱。。基因定位位质量性状状的基因因定位近等基因因系（NearIsogenicLines,NILs）NILs几乎仅在在目标性性状上存存有差异异，一般般凡是能能在近等等基因系系间揭示示多态性性的分子子标记，，就极可可能位于于目标基基因的两两翼附近近。利用NILs方法已定定位了许许多质量量性状基基因，eg.番茄抗病病毒基因因Tm-2a，番茄抗细细菌病毒毒基因及及水稻半半矮杆基基因Sdy等。原理：将将分离群群体(F2、BC、DH）中的个个体依据据目标性性状(如如抗病、、感病)分成两两组，在在每一组组中将若若干个体体DNA等量混合合，形成成两个DNA混合池(如抗病病池和感感病池)。由于于分组时时仅对目目标性状状进行选选择，因因此两个个池之间间理论上上就应主主要在目目标基因因区段存存有差异异，也称称近等基基因池法法。优点：克克服了许许多作物物没有或或难以创创造相应应NILs的限制(Michelmore等1991)。。定位基因因：莴苣苣抗霜霉霉病基因因、水稻抗瘿瘿蠓基因因水稻抗抗稻瘟病病基因、、水稻耐耐黄丛卷卷叶病毒毒病基因因等分离群体体分组分分析法(BulkedSegregationAnalysis)产量、品品质、熟熟期等大大多数重重要农艺艺性状，，均表现现数量性性状的遗遗传特点点，受许许多数量量基因座座位（QuantitativeTraitLoci,QTLs）和环境因因子的共共同作用用。数量遗传传学无法法确定控控制数量性状状的QTLs数目，也也无法确确定单个个QTL的遗传效效应及染染色体位位置。分子连锁锁图谱的的发展，，可以实实现对单单个QTL遗传效应应的追踪踪，从而而应用于于分子标标记辅助助选择。。目前已已发展了了QTLs定位的多种方方法。数量性状状基因的的定位基于图谱谱的基因因克隆谁最先了了解基因因的功能能，谁就就拥有了了该基因因的知识识产权，，也就获获得了更更多的利利润。克隆基因途途径——正正向遗传学学和反向遗遗传学。前者以欲克克隆基因的的功能为基基础，通过过鉴定其产产物或某种种表型的突突变进行；；后者则着眼眼于基因本本身，通过过其特定的的序列或其其在基因组组中的特定定位置进行行。图位克隆条件：(1)目标标基因附近近紧密连锁锁的DNA标记；(2)知道道这些标记记与目的基基因的位置置一旦建立与与目的基因因紧密连锁锁的分子标标记图，就就可以找到到染色体步步行的起始始点，从而而进行定位位克隆。比较基因组组研究利用相同的的DNA分子标记（（主要是cDNA标记和基因因克隆）在在相关物种种之间进行行遗传或物物理作图，，比较这些些标记在不不同物种基基因组中的的分布特点点，揭示染染色体或染染色体片段段上的基因因及其排列列顺序的相相同或相似似性，并由由此对相关关物种的基基因组结构构和起源进进化进行分分析。新发现：不同物种之之间在标记记探针的同同源性、拷拷贝数及连连锁顺序上上都具有很很大程度的的保守性。。eg番茄、马铃铃薯和辣椒椒（Tanksley等1988；1992）；水稻、小麦麦和玉米（（Ahn等，1993；1994）；；小麦、大麦麦和黑麦（（Devos等，1993）；高粱和玉米米（Pereira等，1994）；以及大麦和和水稻（Maroof等，1996）．．．．．．．比较基因组组学研究表表明，不同同物种之间间在标记探探针的同源源性，拷贝贝数及连锁锁顺序上都都具有很大大程度的保保守性。启示：模式式植物上遗遗传作图成成果可推而而广之。可借助比较较基因组共共享分子标标记，使建建立高密度度遗传连锁锁图可资利利用的标记记显著增加加，从而大大大提高了了获取离目目标基因很很近分子标标记的的可可能性。应用比较基基因组学进进行基因的的克隆绿色革命Rht1、Rht2基因的克隆隆拟南芥GAI水稻EST筛选小麦BAC文库Rht1、Rht2Blast探针标记深远意义比较基因组组研究已使使得传统的的植物遗传传学突破了了物种的框框架限定，，发展成了了新的系统统遗传学。。随着最近一一些生物的的基因组全全序列的获获得，比较较基因组研研究也随之之步入了一一个新的时时代。研究基因表表达与调控控传统方法是是利用cDNA文库筛选和和Northern杂交。AFLP研究基因表表达是非常常有效的方方法，可同同时比较植植物发育的的不同时期期以及分离离某些重要要基因（cDNA-AFLP）。利用cDNA-AFLP的方法，阐阐明了马铃铃薯块茎在在不同发育育阶段基因因表达的情情况，并克克隆了2个个与块茎脂脂肪氧合酶酶高度同源源的cDNA片段（Bachem等1996）。在植物育种种上的应用用在杂交育种种中，单单单根据育种种材料的表表型特点选选配亲本，，往往会受受到环境条条件的干扰扰。辅之以DNA分子标记的的差异性分分析，将使使得亲本选选配更为快快速、准确确，从而提提高育种效效率。揭示育种材材料之间的的亲缘关系系杂种优势利利用正成为为许多作物物提高产量量和改善品品质的重要要途径。对遗传差异异与杂种优优势关系的的评价方法法经历了从从形态性状状遗传距离离，到生化化标记遗传传差异，亲亲缘系数，，以及分子子标记遗传传差异等各各种尝试。。杂种优势预预测及机理理研究DNA分子标记的的应用，使使得能够在在整个基因因组范围内内对大量亲亲本材料间间的遗传距距离进行估估测，并在在此基础上上有效地预预测具有强强优势的组组合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。结果：既有相相关性很高的的报道，又有有完全相反的的结果。张启发认为：分子标记杂合合度与杂种优优势的相关性性因遗传材料料而异，在经经过改良的优优良种质中，，两者之间高高度相关，而而在一些未经经改良的优良良种质中，相相关程度很低低。提出了“上位位性是杂种优优势的主要遗遗传基础”的的重要观点。。应用cDNA－AFLP技术进行杂种种优势机理的的研究表明，，强优势与弱弱优势组合间间基因表达有有明显差异，，有增强型、、减弱型和沉沉默型。杂种优势表现现与单亲沉默默、双单亲沉沉默有密切关关系。大量研究表明明，虽然分子子标记揭示的