《基因工程》第二章工具酶

第二章:基因工程工工具酶主讲教师:杨应斌答疑QQ号:715656164基因工程一、DNA限制性内切切酶二、甲基化化酶三、分子克克隆过程中中所需要的的另一些酶酶Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬噬菌体λ的限制作用用各种细菌都都能合成一一种或几种种顺序专一一的核酸内内切酶。这这些酶切割割DNA的双链，因因为它们的的功能就是是切割DNA，限制外源性性DNA存在于自身身细胞内，所以称这这种核酸内内切酶为限限制酶。合成限制酶酶的细胞自自身的DNA可以不受这这种酶的作作用，因为细胞胞还合成了了一种修饰饰酶，它改改变了限制制酶识别的的DNA顺序的结构构，使限制制酶不能起起作用。目前，从各各种生物中中分离出的的限制性内内切酶已接接近200种，其中80多种是切割割DNA双链。（一）命名名原则限制性内切切酶主要是是从原核生生物中提取取的。现在在通用的命命名原则是是：属名种名株名如果同一菌菌株中有几几种不同的的内切酶时时，则分别别用罗马数数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。Haemophilusinflueuzaed酶名HindIIIEscherichiacoliRY13EcoRⅠ（二）分类类和特性第二类限制制性内切酶酶的识别顺顺序是一个个回文顺序,如EcoRI的识别顺序序为：5’……G*A-A-T-T-C……3’3’……C-T-T-A-A*G……5’讨论:下面的序列列中可能含含有多少个个潜在的酶酶切位点?GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA132654一、DNA限制性内切切酶二、甲基化化酶三、分子克克隆过程中中所需要的的另一些酶酶二、甲基化化酶限制-修饰系统中中的修饰作作用是由甲甲基化酶（（methylase）来完成的的。甲基化化酶同限制制性内切酶酶具有完全全相同的识识别顺序。。甲基化酶酶使识别顺顺序中的某个碱基发发生甲基化化，保护DNA不被限制性性内切酶切切开。DNA甲基化酶普普遍存在于于原核和真真核生物中中，能将S-腺苷甲硫氨氨酸上的甲甲基转移到到腺嘌呤或或者是胞嘧嘧啶上。在原核生物物中，DNA甲基化酶作作为限制修修饰系统的的一个组成成部分广泛泛存在，它它们的作用用是保护宿宿主菌不被被相应的限限制性内切切酶切割。。大多数实实验室使用用的大肠杆杆菌包括三三种位点特特异性的DNA甲基化酶。。由dam基因（Dam甲基化酶））编码的甲甲基化酶能能将甲基转转移到GATC序列中的腺腺嘌呤N6位点上。由dcm基因编码的的Dcm甲基化酶，，能在CCAGG和CCTGG序列内部的的胞嘧啶C5位置上甲基基化。EcoKI甲基化酶，，可将AAC（N6A）GTGC和GCAC（N6A）GTT上的腺嘌呤呤进行甲基基化修饰。。(1)原核生物ＤＤＮＡ甲基基化如果限制性性内切酶的的识别位点点是从表达达Dam或Dcm甲基化酶的的菌株中分分离而得，，并且其甲甲基化识别别位点与内内切酶识别别位点有重重叠，那么么该限制性性内切酶的的部分或全全部酶切位位点有可能能不被切割割。例如，从dam+E.coli中分离的质质粒DNA完全不能被被识别序列列为GATC的MboI所切割。E.coli菌株中的DNA甲基化程度度并不完全全相同。pBR322DNA能被完全修修饰（因此此完全不能能被MboI切割），而而λDNA只有大约50%的Dam位点被甲基基化，这是是因为在λDNA被包装到噬噬菌体头部部之前，甲甲基化酶还还没来得及及将DNA完全甲基化化。因此，，被Dam或Dcm甲基化完全全阻断的酶酶却能对这这些λDNA进行部分切切割。被Dam或Dcm甲基化的限限制性位点点可以通过过克隆DNA至dam-/dcm-菌株【如dam-/dcm-E.coli感受态细胞胞（NEB#C2925）】进行去甲基基化。(1)真核生物ＤＤＮＡ甲基基化在高等真核核生物（如如Dnmt1）中发现的的CpG甲基转移酶酶（CpGMTases），将甲基基基团转移移至胞嘧啶啶残基上的的C5位点。CpG甲基化形式式受遗传因因素的影响响，具有组组织特异性性，并与基基因表达相相关。因此此，我们推推测CpG甲基化在基基因分化和和表达中起起了一定的的作用。在消化真核核基因组DNA时尤其要关关注CpG甲基化的影影响。需要要注意的是是，一旦DNA被克隆到宿宿主菌中，，将不存在在CpG甲基化形式式。一、DNA限制性内切切酶二、甲基化化酶三、分子克克隆过程中中所需要的的另一些酶酶（一）DNA聚合酶（二）RNA聚合酶（三）反转转录酶（四）核酸酸外切酶（五）核酸酸酶S1（六）DNA酶（七）RNA酶（八）连接接酶（九）末端端转移酶（十）碱性性磷酸酶（一）DNA聚合酶（DNapolymerase）的作用是是将1个脱氧三磷磷酸核苷酸酸加到引物物（primer）的3’-OH上，释放出出一个焦磷磷酸分子（（ppi)聚合酶主要要有以下两两种种：1．大肠杆菌菌DNA聚合酶Ⅰ2．噬菌体DNA聚合酶1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.ColiDNApolymerase）主要有3种作用：①5’→3’’的聚合作用用。但不是复制制染色体而而是修补DNA，填补DNA上的空隙或或是切除RNA引物后留下下的空隙。。②3’→5’’的外切酶活活性。消除在聚合合作用中掺掺入的错误误核苷酸。。③5’→3’’外切酶活性性。切除受损伤伤的DNA。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段段，只有在在5’→3聚合酶活性性和3’→5’’外切酶活性性，失去了了5’→3外切酶活性性。2．噬菌体DNA聚合酶这里以T4DNA聚合酶为例例。它也具具有5’→3聚合酶活性性，但它的的外切酶活活性比大肠肠杆菌的要要高200倍。因此，，它也可用用来补齐单单链末端或或标记同位位素。催化转录的RNA聚合酶是一一种由多个个蛋白亚基组成的复合合酶。（二）RNA聚合酶真核生物的的RNA聚合酶真核生物的的RNA聚合酶分三三类：RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁仁中，转录录rRNA顺序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核质质中，转录录大多数基基因，需要要“TATA””框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核质质中，转录录很少几种种基因如tRNA基因如5SrRNA基因。（三）反转转录酶反转录酶（（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指导