高二生物【4】基因工程的基本程序

基因工程的基本程序（1）高二年级生物知识回顾DNA重组技术的基本工具限制酶DNA连接酶运载体限制酶作用结果来源作用种类

条件种类

“分子手术刀”--限制性核酸内切酶简称限制酶。作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。结果：形成黏性末端或平末端。来源：主要来自原核生物小结DNA重组技术的基本工具限制酶DNA连接酶运载体限制酶作用结果来源作用种类

条件种类

“分子缝合针”—DNA连接酶作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。种类：E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶小结DNA重组技术的基本工具限制酶DNA连接酶运载体限制酶作用结果来源作用种类

条件种类

“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体条件（1）一个或多个限制酶切割位点：供目的基因插入其中（2）自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上，

随染色体DNA同步复制（3）标记基因：供重组DNA的鉴定和选择种类：质粒（常用）、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒质粒同种限制酶切

DNA连接酶连重组DNA（重组质粒）

第一步：目的基因的获取基因组DNA（目的基因）

第二步：基因表达载体的构建

第三步：目的基因导入受体细胞

第四步：目的基因检测与鉴定一、学习目标1.简述基因工程原理及基本操作程序。2.尝试设计某一转基因生物的研制过程二、学习重点和难点1.学习重点基因工程基本操作程序的四个步骤(第一二步）。2.学习难点从基因文库中获取目的基因。利用PCR技术扩增目的基因。。一、目的基因的获取目的基因主要是编码蛋白质的基因获取目的基因的方法1.从基因文库中获取2.利用PCR技术扩增3.人工合成1、从基因文库中获取目的基因基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库的种类:基因组文库一种生物所有基因多针对原核生物部分基因文库一种生物部分基因多针对真核生物基因文库的构建基因组文库cDNA文库问题1：真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？基因的结构原核真核编码区非编码区非编码区启动子终止子RNA聚合酶结合位点外显子内含子真核细胞的cDNA的获取内含子真核编码区非编码区非编码区启动子终止子外显子

RNA聚合酶转录mRNA前体相关酶剪切mRNA核酸酶H单链DNA逆转录酶RNA链DNA链杂交双链DNA聚合酶cDNA无启动子、终止子、内含子基因组文库与cDNA文库的比较

文库类型

cDNA文库

基因组文库

文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）无有

基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因

物种间的基因交流可以部分基因可以问题2：能否从某人的垂体细胞中获取他的胰岛素基因的mRNA？问题3：同一个体不同细胞中提取mRNA构建的cDNA文库是否相同？基因的选择性表达人体细胞垂体细胞胰岛B细胞胰岛A细胞生长激素基因+++胰岛素基因+++胰高血糖素基因+++生长激素基因的mRNA

+--胰岛素基因的mRNA

-+-胰高血糖素基因的mRNA

--+2、利用PCR技术扩增目的基因多聚酶链式反应PCR技术原理：体外DNA复制PCR过程体内DNA复制过程解旋酶DNA聚合酶体内DNA复制需要模板、原料、引物、酶、能量等引物PCR过程也需要模板、原料、引物、酶、能量等模板DNA95℃变性高温解旋95℃50℃复性引物结合引物1引物2DNA引物72℃延伸Taq酶合成子链引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶72℃第一轮结束第二轮开始95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq72℃第二轮结束PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增PCR扩增仪体内DNA复制体外PCR扩增共同点：都需要模板、原料、引物、酶、能量等解旋酶高温DNA聚合酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶）3、人工合成目的基因在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪直接人工合成质粒同种限制酶切

DNA连接酶连重组DNA（重组质粒）

第一步：目的基因的获取基因组DNA（目的基因）

第二步：基因表达载体的构建基因文库获取人工合成PCR扩增二、基因表达载体的构建(核心）问题4：运载体必备条件？一个或多个限制酶切割位点：供目的基因插入其中自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上，随染色体DNA同步复制标记基因：供重组DNA的鉴定和选择基因的结构原核真核编码区非编码区非编码区启动子终止子RNA聚合酶结合位点外显子内含子1.基因表达载体组成：启动子:目的基因终止子：标记基因：复制原点是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。2.基因表达载体的构建目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代（复制原点）同时使目的基因能够表达和发挥作用

（启动子+目的基因+终止子）3.基因表达载体构建过程：同种限制酶切质粒

DNA连接酶连重组DNA（重组质粒）目的基因模拟基因表达载体（重组DNA分子）的构建剪刀：代表限制酶透明胶带：代表DNA连接酶想一想、做一做：1.目的基因可以自身连接成环吗？质粒呢？2.只考虑两两连接产物足够多的目的基因、质粒可以连接成几种情况？目的基因自身环化质粒自身环化目的基因与质粒正向连接成环DNA连接酶：磷酸二酯键目的基因与质粒反向连接成环二、基因表达载体的构建问题5：只考虑两两连接产物。足够多的目的基因、质粒可以连接成几种情况？目的基因和目的基因相连质粒和质粒相连重组DNA（重组质粒）目的基因和质粒相连小结生物材料DNAmRNA一定大小范围DNAcDNA文库

cDNA（互补DNA）PCR基因文库人工合成

第一步：目的基因的获取

第二步：基因表达载体的构建反转录限制酶切割包括组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因工具：限制酶、DNA连接酶、运载体基因组文库练习1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高练习1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是(C)A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高练习2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是

()

①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因

③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成

A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③练习2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是

(D)

①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因

③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成

A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③练习3.

如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切酶。下列说法错误的是()A．图示过程是基因工程的核心步骤B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构练习3.

如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、Sma