细胞工程动物染色体工程

关于细胞工程动物染色体工程第1页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五ChromosomesandInheritanceSincegenesarecarriedonchromosomes,knowledgeofchromosomenumberandstructurehasfar-reachingimplicationsforbasicgenetics,humanhealth,andevolution.Anormalhumanmalekaryotype.第2页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Chromosomestructure第3页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五ChangesinChromosomeNumberandStructureChangesinchromosomenumberandstructureareimportantforhealthandevolution.Downsyndromeiscausedbyachangeinchromosomenumber.第4页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五染色体变异染色体数变异一种是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，这产生的变异导致多倍体或单倍体；另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。第5页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五染色体变异染色体结构变异染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。染色体复制：一个染色体上增加了相同的某个区段。第6页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Thereare4typesofchromosomestructuralchange–allofthemassociatedwithhumandisordersChromosomeStructuralChanges易位缺失倒位复制第7页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五什么是染色体工程？定义：是指人们按照预先的设计，消减、添加或替换同种或异种动物细胞染色体的技术。Rich和Khush于1966年最先提出这一概念。第8页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第一节多倍体诱导（polyploidyinduction）第二节雌核发育（gynogenesis）雄核发育（androgenesis）性别控制（sexcontrol）第三节染色体片段转移

(transferofchromosomefragment)染色体特定位点重组

(region-specificrecombinationofchromosome)

第9页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第一节动物多倍体诱导多倍体（polyploid）Winkler(1916年)首先使用的，它是指体细胞中含有三个或更多染色体组的个体。在高等植物中相当多，但动物中却少得多。60年代发现一种美洲角蛙是四倍体动物，之后陆续在低等脊椎动物中发现许多多倍体动物。银鲫第10页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五多倍体第11页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五由于多倍体动物生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视。鱼类和贝类都是重要的水产养殖动物，多为体外产卵、体外受精和体外发育，因而人工诱导多倍体的研究在鱼类和贝类已取得很大进展。三倍体太平洋牡蛎第12页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五(一)人工诱导多倍体的机制人工诱导染色体加倍主要有抑制受精卵第二极体排放(三倍体)或抑制受精卵的第一次卵裂(四倍体)抑制第一极体的排放-很少采用，鱼类不成功，贝类畸形率高。第13页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五1stpolarbody2ndpolarbody第14页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五精子入卵时卵子所处的时相是不同的贻贝、玻璃海鞘和毛翼虫等。大多数脊椎动物和文昌鱼等如海滨蛤、海绵、蛔虫、沙蚕如海胆和腔肠动物第15页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五三倍体诱导第16页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五(二)人工诱导多倍体的方法1、生物学方法

主要采用杂交方法，尤其是种间杂交的方法。雌性草鱼2n=48与雄性三角鲂2n=48杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体，其中草鱼提供了二倍数目的染色体48，三角鲂提供了单倍数目的染色体24。为什么种间杂交会导致草鱼第二极体不排出，从而导致多倍体产生？第17页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五2、物理学方法⑴温度休克法

冷休克法0-5℃

热休克法30℃左右必须要优化的三个因素：处理时刻（即处理开始时间，一般从受精开始算起）、处理持续时间和处理温度。一般说来，冷水性鱼类采用热休克，而温水性鱼类如鲤科和鲷科鱼类采用冷休克效果好。第18页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五2、物理学方法⑵静水压法

较高的水静压650kg/cm2，诱导率高90-100%，时间短3~5min，损伤小，成活率高。需要专门设备如水压机，成本高；样品室容量有限，不适于大规模生产。⑶高盐高碱法

高pH值或高盐的条件，尚待完善。

第19页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五3、化学方法秋水仙碱(colchicine)：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。细胞松弛素(cytochalasinB)：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。聚乙二醇(polyethyleneglycol)其他如麻醉剂(N2O和CHClF2)药品有毒性，且多嵌合体，很少被使用。

第20页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（三）多倍体倍性鉴定原因：所处理的受精卵不能百分之百地成为多倍体，且常表现为嵌合体。直接方法：染色体计数和DNA含量测定等。间接方法：核体积测量法(细胞核大小与染色体数目成正比)、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查等。第21页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五染色体计数：准确、直接的方法。DNA含量测定：流式细胞仪。核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳：生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。第22页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五多倍体动物的生活力及生长能力。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率，三倍体种间杂种可以比二倍体杂种成活得更好一些。（四）多倍体动物的应用前景第23页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五三倍体的优势三倍体性腺不育：不需要消耗能量用于性腺的发育，避免了繁殖季节的肉质下降、生长停滞和死亡率增高，缩短了养殖周期，降低了养殖成本。利用三倍体的不育性来控制养殖密度，防止品种混杂和退化。第24页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五三倍体的缺点三倍体的高度不育不利于种质保存，每次都需重新诱导。培育四倍体，性成熟后与二倍体杂交，获得不育的三倍体种苗，是当前的热门课题。第25页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五多倍体动物的其它经济性状三倍体虹鳟的鱼肉质量确实优于二倍体，其抗传染性造血器官坏死病毒能力较强；三倍体大西洋鲑耐低氧，故可适用于低氧环境养殖；三倍体香鱼对声音和光线的感受能力比二倍体香鱼略显迟钝，适于在噪音较大的环境中放养。第26页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第二节雌、雄核发育和性别控制意义：产生单性种群，在纯系建立、性别控制、遗传机制研究等方面具有重要的理论和实际意义。（一）雌核发育(Gynogenesis)定义俗称假受精，指精子虽然正常地进入卵内，激动卵子，但其细胞核并未参与胚胎发育，而是很快消失，胚胎发育仅在母体遗传的控制下进行，因而雌核发育个体完全表现母本性状，其基因型也与母本相同。第27页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五雌核发育不同于孤雌生殖它需要同种或异种精子进入卵子，来启动胚胎发育。同型雌性配子，后代都是雌性个体，异型雌性配子，后代雌性雄性都有。蜜蜂进行孤雌生殖产生的单倍体卵发育成雄蜂，二倍体受精卵发育成雌蜂。第28页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（二）人工诱导雌核发育可分为两步：雌核发育的诱导雌核发育卵子的二倍体化

第29页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五1、雌核发育的诱导即采用生物、物理或化学的方法使精子的遗传物质失活，然后用失活精子与卵子受精，启动卵子的雌核发育。精子虽然入卵，但并不会和雌原核融合，精原核最终降解消失，不参与胚胎发育，只起启动卵子胚胎发育的作用。第30页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第31页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五生物学方法：远缘精子受精，不与卵原核融合。异种精子可能提供中心粒物理学方法：

-射线、-射线或紫外线照射精子，使DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体。玻璃针刺激鱼卵或用弱电流来处理鱼卵。化学方法：甲基硫酸乙烷（EMS）、咔碇黄、噻嗪、乙烯脲等处理精子。第32页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五2、雌核发育卵子的二倍体化含有单倍染色体组的受精卵，胚胎不能正常发育--单倍体综合症。必须使雌核发育的卵子染色体二倍体化，才能使胚胎正常发育。诱导染色体加倍的方法和多倍体诱导相同：一是抑制第二极体的排放，二是抑制第一次卵裂。

第33页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（三）雌核发育的鉴别1、染色体数目和染色体组型分析法--准确2、遗传标记法--标记基因和着丝粒的距离3、表型特征鉴别法第34页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五“中科三号”利用银鲫双重-雌核和有性生殖方式，从高体型(D系)异育银鲫(♀)与平背型(A系)异育银鲫(♂)交配所产后代中选育出来，再经异精雌核生殖培育而来的异育银鲫新品种。第35页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五二、雄核发育androgenesis定义：是指卵子经过射线照射等处理，使其遗传失活，再与正常精子受精，然后采用适当的方法使精子的染色体加倍为二倍体，发育成完全父本性状的纯合个体。意义：纯合体，在遗传育种中具有重要的理论和实际意义，种质保存。研究较少第36页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五三、动物的性别控制定义：是指通过人为地干预或操作，使动物按照人们的设计繁殖出所需性别后代的技术。动物性别控制在畜牧业、家禽养殖业、水产养殖业和养蚕业等方面都有重要的经济意义。第37页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五(一)性别决定的遗传类型1雄性异配子型XY型和XO型2雌性异配子型ZW型和ZO型3雄性单倍体型如蜜蜂4内在环境决定型如蚯蚓、玉米和苹果等。5外在环境决定型如蝌蚪

20℃，雌雄各半；30℃，全雄。染色体组成不变。第38页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五(二)家畜性别控制的途径1.X、Y精子分离技术2.胚胎性别鉴定技术3.控制受精条件调节阴道的酸碱度。

偏酸雌性；偏碱雄性。在精液中加入激素或睾丸、胎盘、脑垂体等组织的抽提物。第39页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五(三)鱼类、两栖类和爬行类的性别控制途径控制发育条件性反转人工雌核和雄核发育种间杂交三倍体不育第40页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五1、控制发育条件发育温度蝌蚪性别。鳄鱼：无性染色体。30℃,全雌；34℃以上,全雄；32℃,雌/雄之比为1:5；大于36℃，低于26℃下,胚胎死亡。第41页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五产卵地点扬子鳄：潮湿阴暗处，较多雌体；阳光暴晒处，较多雄体。1、控制发育条件第42页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五2、性反转鱼类：投喂雌激素或雄激素，性别改变。但染色体没有改变。

将性反转法和交配技术以及雌核发育技术结合起来培育全雌或全雄鱼。第43页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五一、染色体片段转移技术定义：指通过显微注射法将外源染色体片段注入受体胚胎中，获得转染色体动物(Transomics)的技术。方法：显微切割特定的染色体片段，然后注入受体动物受精卵中，并可在受体动物中表达该染色体片段的性状。不完全雌核发育也可以将外源染色体片段导入受体动物体内。不需经基因重组构建载体可转移超大型外源DNA。

第三节染色体片段转移和特定位点重组技术第44页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五二、染色体特定位点重组技术能够在特定位点诱发染色体的各种重排。该技术与小鼠胚胎干细胞技术以及基因打靶技术相结合，成为染色体工程中的一个新的亮点。第45页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第46页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五构建含有一段同源序列（与靶基因）的载体。neor基因：新霉素抗性基因，正选择作用，同源序列内部。HSV-tk基因：疱疹病毒胸苷激酶，负选择作用，同源序列之外。5’3’neorHSV-tk同源序列同源序列同源重组第47页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第48页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Positive-negative-selection

正负双向选择

应用G418正向选择发生重组事件后将neo’基因导入基因组的ES细胞;反向选择是根据同源重组发生时，载体末端的HSV-tk基因将被去除，在Ganciclovir存在时能存活，相反随机整合者，由于HSV一tk的存在而被Ganciclovir杀死，从而起到很高效的选择作用，富集了同源重组这一小概率事件，使基因打靶操作更为有效。第49页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第50页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第51页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Cre-loxP重组系统

Cre-loxPrecombinationsystem）Cre重组酶来源于P1噬菌体。作用特点：

在大肠杆菌体内或体外，都能启动DNA分子间或分子内的联合与重组；

重组发生在一个被称为loxP的特异位点，且不需要其他的蛋白质因子。

在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组。第52页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五PropertiesofCreandFlp•Sitespecific:位点特异性--34bp非对称靶序列34bpasymmetricrecognitiontargetsequence•Conservative:保守--无核苷酸增加或减少recombinationoccurswithoutanyoverallgainorlossofnucleotides•Simple:简单--不需要其他因子或能量recombinasefunctionsautonomously,nocofactorsorATPrequired第53页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五特定位点重组酶识别位点第54页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五•Substratetopology:底物的拓扑结构supercoiledcircular,relaxedcircularorlinearDNA•Heritableproduct:可遗传的产物resultantgeneticalterationisstableandheritable•Broadutility:广泛的应用functioninawiderangeofcelltypes,includingundifferentiatedaswellaspost-mitoticcellsfunctionoverlargedistances(Mb)PropertiesofCreandFlp第55页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Cre-loxP重组系统示意图Cre酶作用于基因组上loxP位点Cre酶使两个loxP位点联合两个loxP位点发生同源重组切除X基因及一个loxP位点而仅留下一个loxP位点。第56页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第57页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Cre-mediatedRecombination第58页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第59页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五染色体特定位点重组技术构建要导入靶细胞的靶载体首先，将载体导入胚胎干细胞（ES），筛选出发生同源重组的puro抗性细胞；筛选和鉴定；最后，用Cre表达质粒转染细胞并瞬时表达，表达产生的重组酶Cre催化loxP位点间的染色体发生重组。第60页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第61页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第62页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第63页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第64页，共69页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Applications•GenetargetingKnock-out/Knock-in/Conditionalknock-out•Chromosomeengineering/ablationLargedeletionChromosomerearrangementGenom