肝脏基础知识与肝间充质细胞制备课件

一肝脏的形态结构二肝脏的功能三肝脏细胞类型及制备扩增四肝干细胞及临床应用五问题与挑战六总结

一肝脏的形态结构一、肝的形态结构1、肝膈面

肝上面膨隆，与隔相接触，称膈面。膈面有镰状韧带附着，将肝分为左右两叶，左叶小而薄，右叶大而厚。膈面后部没有腹膜被覆的部份称裸区，其左侧有一较宽的沟，称腔静脉沟，下腔静脉由此通过。肝表面除裸区及各沟处以外，都有浆膜覆盖。浆膜在胚胎10周后形成。一、肝的形态结构1、肝膈面肝上面膨隆，与隔相接触，称

肝靠近腹腔的一面叫肝面，脏面中部有略呈“H”形的三条沟，中间横行的沟又称肝门，有肝左、右管。肝固有动脉左、右支，肝门静脉左、右支和肝的神经、淋巴管由此进入。左侧的纵沟较窄而深，沟的前部有肝圆韧带通过，称肝圆韧带支，肝圆韧带由胎儿时期的脐静脉闭锁而成,经肝镰状韧带的游离缘内行致脐。后部容纳静脉，称静脉韧带裂。肝面分为4个叶：肝左叶位于肝圆韧带左侧，肝右叶位于胆囊窝与腔静脉右侧，方叶位于肝门前，胆囊窝与肝圆韧带之间，尾状叶位于肝门之后，

静脉韧带裂与腔静脉沟之间。

肝靠近腹腔的一面叫肝面，脏面中部有略呈“H”形的2、肝腹面2、肝腹面二、肝的功能肝脏是人体中最大的腺体，也是最大的实质性脏器，约占体重的1/40～1/50。肝的功能极其复杂，参与多种有机物合成以及休内物质的分解代谢，主要功能如下：第一解毒功能。第二代谢功能第三分泌胆汁。第四造血、储血和调节循环血量的功能。第五免疫防御功能。第六肝脏再生功能。二、肝的功能肝脏是人体中最大的腺体，也是最大的实三、肝脏细胞类型及制备扩增

肝脏是一个极其复杂的器官，大约由50万个肝小叶以及其它一些附属结构组成。除了主要的肝实质细胞外(60%)，还有其它种类的非实质细胞。非实质细胞占肝脏体积的6.5%，主要有内皮细胞、星状细胞、库普弗细胞（Kupffercell），分别占非实质细胞比例的50-60%、30-35%、13%。三、肝脏细胞类型及制备扩增肝脏是一个极其复杂的器官肝实质细胞非实质细胞新发现细胞肝窦内皮细胞库普弗细胞肝星形细胞肝间充质细胞胆管上皮细胞Pit细胞肝脏干细胞卵圆细胞肝实质细胞肝实质细胞非实质细胞新发现细胞肝窦内皮细胞Pit细胞肝实质细肝脏细胞表面标记细胞种类标记物肝实质细胞甲胎蛋白、清蛋白、Ecadherin和白蛋白（成熟肝细胞）星状细胞标记NCAM或smcActin肝窦内皮细胞标记SE1库普弗细胞过氧化物酶、酸性磷酸酶等组织化学方法Pit细胞DX8、CD8（类似NK）间充质细胞CD44+、CD34-、CD13+、CD14-等肝脏细胞表面标记细胞种类标记物肝实质细胞甲胎蛋白、清蛋白、E3.1什么是间充质干细胞？间充质干细胞是一种分化程度低、无紧密联系，分化能力很强的细胞。在胚胎期可以分化成多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等。在成年的动物的结缔组织中仍然可以看见一些具有发育潜力的间充质细胞，可发育成骨细胞、软骨细胞、骨骼基质甚至肝脏细胞等。由于MSC存在着多种发育潜能以及易于体外培养，MSC在细胞治疗及基因治疗中有着重要作用。3.1什么是间充质干细胞？间充质干细胞是一种分化3.2肝间充质干细胞制备取出肝脏消化组织接种、冻存离心去红剪碎组织计数、分选离心去红传代培养3.2肝间充质干细胞制备取出肝脏消化组织接种、冻存离心去红剪1.剪碎组织肝脏附属结构指胆囊、动静脉、肝浆膜等，10周以上肝膜才能形成。2.离心去红细胞30g5min去红细胞，当肝脏较小时，可以直接200g8min离心去上清。3.消化组织按1：1比例加入胶原酶（消化时间视实际情况而定。4.消化后去红细胞全部组织消化后30g5min去红细胞，一般去红三次，当上清显浅黄色时即可。5.免疫磁珠细胞分选(MACS)用已包被抗体的磁珠与细胞表面分子特异性结合，磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱上，实现阳性细胞分离。本实验室用Ecadherin作为肝实质细胞分选标记。注：12周以下或镜下观察肝实质细胞较多时，直接冻存细胞。1.剪碎组织肝脏附属结构指胆囊、动静脉、肝浆膜等，103.3肝间充质干细胞传代培养

去红1.48h后去红细胞；2.2000g离心上清10min；3.PBS洗1-2次；4.加入离心后上清换液1.原代制备第四天去红；2.根据细胞密度和状态半量换液或全量换液传代、冻存1.P0代传代时间一般4-7天；2.其它代数传代一般为48-60小时，最好不要超过72小时。3.3肝间充质干细胞传代培养

去红换液传代、冻存3.4肝非实质细胞分离培养

前面已提到，非实质细胞主要就是内皮细胞、星状细胞、库普弗细胞，星状细胞密度较小，平均为1.04g/cm3，一般用尼可登（Nycodenz）密度梯度离心即可，但由于内皮细胞、库普弗细胞密度较为接近，且存在较大的重叠区域，密度梯度离心很难将两都分开，使用离心淘洗法可以得到较纯的细胞。3.4肝非实质细胞分离培养前面已提主要液体配制：1.前灌注液：用不含Ca++、Mg++的D-Hanks溶液配制。内含NaCl137mmol/L，KCl5.4mmol/L，NaH2PO40.5mmol/L，HEPES10mmol/L，用0.1MNaOH调节至PH7.4，过滤除茵。使用前加入无菌肝素125U/ml。2.酶灌注液：用含Ca++的GBSS溶液配制。1升去离子水内加KCl0.37g，MgSO4.7H2O0.07，HaH2PO40.133g，NaHCO30.227g,KH2PO40.03g,MgCl2.6H2O0.21g,HEPES4.8g,glucose1.0g,0.05mmol/LCaCl2.作用前加0.05%胶原酶，10mg/100mlDNAaseI，用0.1MNaOH调至PH7.5，过虑除菌。3.酶消化液：用含Ca++的GBSS溶液配制。内含0.03%胶原酶，10mg/100mlDNaseI，PH7.5过虑除菌4.Nycodenz溶液：根据体积重量比的方法配制。称取适量Nycodenz，溶于90mlGBSS中，搅拌混匀，用GBSS溶液定容至100ml，过虑除菌，4℃保存。5.淘洗液：用RPMI-1640培养基按说明书配制，另加HEPES10mmol/L，青、链霉素各100U/ml，使用前再加1%的胎牛血清。主要液体配制：分离过程1.原位肝脏灌注（鼠为实验对象）麻醉动物--静脉插管--前灌注液--酶灌注液--分离肝脏--酶消化液消化--200目过滤--100g/5min离心两次（收集上清）--500g/7min离心（弃上清）--GBSS或D-Hanks重悬2.分离肝星形细胞（1）用10mlD-Hanks重悬细胞，再加入7ml33%Nycodenz，混匀后再小心在上面再铺一层D-Hanks。（2）1500g离心20min取细胞悬与D-Hanks夹层细胞，DMEM培养液重悬细胞，500g/7min离心两次，计数、接种。分离过程1.原位肝脏灌注（鼠为实验对象）3.离心淘洗法分离内皮细胞、库普弗细胞（1）将18%的Nycodenz溶液与细胞悬液按2：1体积比铺层，最上层再小心铺上一层D-Hanks.（2）4℃1400g离心10min，取中间层液体，D-Hanks稀释，500g7min反复离心洗涤。培养液重悬成10ml。（3）离心淘洗分离。3.离心淘洗法分离内皮细胞、库普弗细胞离心淘洗术原理离心淘洗技术是根据反向流动离心原理设计的。在整个离心淘洗过程中,淘洗室内悬浮液中的细胞受到两个相反方向的力:离心力(离心转速)和向心力(泵控流速)并处于平衡状态。当淘洗室内悬浮液往离心转轴方向流动时，随着淘洗室壁逐渐变宽，悬浮液流速逐渐变慢，这样就形成了一个速度梯度；从离心转轴近端至远端，离心力逐渐增大，也形成一个速度梯度，这两者刚好相反。沉降速度跟细胞大小和密度有关，体积、密度较小的细胞由于沉降速度低先被洗脱出来，较大的细胞由于沉降速度高则滞留在淘洗室入口，这里流速和转速都很高；体积、密度中等的细胞则在淘洗室壁最宽处保持平衡。离心力不变时,通过增加淘洗液的流速可以使体积、密度大的细胞也被淘洗出来。离心淘洗术原理离心淘洗技术是根据反向流动离心原理离心淘洗术原理离心淘洗术原理四、肝干细胞及临床应用肝移植是目前治疗终末期肝病的主要方法，但供肝短缺限制了其应用，导致许多患者未能获得肝移植。近年来，肝细胞的分离鉴定、纯化培养技术日渐成熟，在动物实验和临床研究中均取得了较大进展。四、肝干细胞及临床应用肝移植是目前治肝脏疾病肝脏相关性疾病基因性疾病代谢性缺陷Wilson氏病先天性高胆红素血症A1抗胰蛋白酶缺陷症家族性高胆固醇血症血噗啉病侯糖代谢障碍脂代谢疾病,如NiemannPick病凝血性疾病酪胺酸血症血友病A获得性疾病免疫性疾病急/慢性肝功能衰竭遗传性血管神经性水肿慢性病毒性肝炎、肝硬化凝血因子IX缺陷可用于肝细胞移植的疾病肝脏疾病肝脏相关性疾病基因性疾病代谢性缺陷Wilson氏病先

移植肝细胞能很好提供近期或长期肝的功能，相对于肝移植，肝细胞移植简单易行，可通过手术或介入置管于脾动脉、门静脉系统完成，可以多次进行移植。肝细胞移植为急性肝功能衰竭、肝坏死等严重疾病提供了新的医治方法，延长了患者寿命以等待肝的移植，同时，移植细胞还在一定程度下参与修复肝脏。

移植肝细胞能很好提供近期或长期肝的功能，相对于肝肝干细胞来源肝干细胞其它胚胎干细胞成体干细胞骨髓干细胞肝干细胞来源肝干细胞其它胚胎干细胞成体干细胞骨髓干细胞

与肝细胞移植一样，肝脏干细也取得了较大进展。Fang在将干细胞移植入肝硬化小鼠的肝脏内发现肝损伤程度减轻，并且移植的干细胞分化为肝细胞并表达白蛋白。Kashofer等将纯化的造血干细胞移植入I型酪氨酸血症模型大鼠体内，重建了肝脏的生化功能，缓解了病情。与肝细胞移植一样，肝脏干细也取得了较大进展六、总结1，细胞培养过程中，最基本的一点是要有无菌意识，从而从各个方面避免污染。2，细胞是有生命的，操作过程中一定要认真、细心、轻柔，减少或避免对细胞的损伤。3，细胞培养过程中一定要严格尊守实验室相关规定，有责任心。4，干细胞是比较前沿的行业，有许多的问题有待研究，所以平时一定要多学，努力提高自身知识水平。六、总结1，细胞培养过程中，最基本的一点是要有无菌意识，从而五，面临的挑战肝干细胞的研究已经在动物模型和临床研究中取得了部分成功，为最终治愈肝脏疾病开辟了新的研究方向。但同时也存在着许多的问题、挑战。1.组织来源，伦理问题2.细胞分离鉴定，如；确切的标记物3.细胞安全性，如：如何防止其癌变？4.法律法规有待完善...五，面临的挑战肝干细胞的研究已经在动物模型和临床一肝脏的形态结构二肝脏的功能三肝脏细胞类型及制备扩增四肝干细胞及临床应用五问题与挑战六总结

一肝脏的形态结构一、肝的形态结构1、肝膈面

肝上面膨隆，与隔相接触，称膈面。膈面有镰状韧带附着，将肝分为左右两叶，左叶小而薄，右叶大而厚。膈面后部没有腹膜被覆的部份称裸区，其左侧有一较宽的沟，称腔静脉沟，下腔静脉由此通过。肝表面除裸区及各沟处以外，都有浆膜覆盖。浆膜在胚胎10周后形成。一、肝的形态结构1、肝膈面肝上面膨隆，与隔相接触，称

肝靠近腹腔的一面叫肝面，脏面中部有略呈“H”形的三条沟，中间横行的沟又称肝门，有肝左、右管。肝固有动脉左、右支，肝门静脉左、右支和肝的神经、淋巴管由此进入。左侧的纵沟较窄而深，沟的前部有肝圆韧带通过，称肝圆韧带支，肝圆韧带由胎儿时期的脐静脉闭锁而成,经肝镰状韧带的游离缘内行致脐。后部容纳静脉，称静脉韧带裂。肝面分为4个叶：肝左叶位于肝圆韧带左侧，肝右叶位于胆囊窝与腔静脉右侧，方叶位于肝门前，胆囊窝与肝圆韧带之间，尾状叶位于肝门之后，

静脉韧带裂与腔静脉沟之间。

肝靠近腹腔的一面叫肝面，脏面中部有略呈“H”形的2、肝腹面2、肝腹面二、肝的功能肝脏是人体中最大的腺体，也是最大的实质性脏器，约占体重的1/40～1/50。肝的功能极其复杂，参与多种有机物合成以及休内物质的分解代谢，主要功能如下：第一解毒功能。第二代谢功能第三分泌胆汁。第四造血、储血和调节循环血量的功能。第五免疫防御功能。第六肝脏再生功能。二、肝的功能肝脏是人体中最大的腺体，也是最大的实三、肝脏细胞类型及制备扩增

肝脏是一个极其复杂的器官，大约由50万个肝小叶以及其它一些附属结构组成。除了主要的肝实质细胞外(60%)，还有其它种类的非实质细胞。非实质细胞占肝脏体积的6.5%，主要有内皮细胞、星状细胞、库普弗细胞（Kupffercell），分别占非实质细胞比例的50-60%、30-35%、13%。三、肝脏细胞类型及制备扩增肝脏是一个极其复杂的器官肝实质细胞非实质细胞新发现细胞肝窦内皮细胞库普弗细胞肝星形细胞肝间充质细胞胆管上皮细胞Pit细胞肝脏干细胞卵圆细胞肝实质细胞肝实质细胞非实质细胞新发现细胞肝窦内皮细胞Pit细胞肝实质细肝脏细胞表面标记细胞种类标记物肝实质细胞甲胎蛋白、清蛋白、Ecadherin和白蛋白（成熟肝细胞）星状细胞标记NCAM或smcActin肝窦内皮细胞标记SE1库普弗细胞过氧化物酶、酸性磷酸酶等组织化学方法Pit细胞DX8、CD8（类似NK）间充质细胞CD44+、CD34-、CD13+、CD14-等肝脏细胞表面标记细胞种类标记物肝实质细胞甲胎蛋白、清蛋白、E3.1什么是间充质干细胞？间充质干细胞是一种分化程度低、无紧密联系，分化能力很强的细胞。在胚胎期可以分化成多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等。在成年的动物的结缔组织中仍然可以看见一些具有发育潜力的间充质细胞，可发育成骨细胞、软骨细胞、骨骼基质甚至肝脏细胞等。由于MSC存在着多种发育潜能以及易于体外培养，MSC在细胞治疗及基因治疗中有着重要作用。3.1什么是间充质干细胞？间充质干细胞是一种分化3.2肝间充质干细胞制备取出肝脏消化组织接种、冻存离心去红剪碎组织计数、分选离心去红传代培养3.2肝间充质干细胞制备取出肝脏消化组织接种、冻存离心去红剪1.剪碎组织肝脏附属结构指胆囊、动静脉、肝浆膜等，10周以上肝膜才能形成。2.离心去红细胞30g5min去红细胞，当肝脏较小时，可以直接200g8min离心去上清。3.消化组织按1：1比例加入胶原酶（消化时间视实际情况而定。4.消化后去红细胞全部组织消化后30g5min去红细胞，一般去红三次，当上清显浅黄色时即可。5.免疫磁珠细胞分选(MACS)用已包被抗体的磁珠与细胞表面分子特异性结合，磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱上，实现阳性细胞分离。本实验室用Ecadherin作为肝实质细胞分选标记。注：12周以下或镜下观察肝实质细胞较多时，直接冻存细胞。1.剪碎组织肝脏附属结构指胆囊、动静脉、肝浆膜等，103.3肝间充质干细胞传代培养

去红1.48h后去红细胞；2.2000g离心上清10min；3.PBS洗1-2次；4.加入离心后上清换液1.原代制备第四天去红；2.根据细胞密度和状态半量换液或全量换液传代、冻存1.P0代传代时间一般4-7天；2.其它代数传代一般为48-60小时，最好不要超过72小时。3.3肝间充质干细胞传代培养

去红换液传代、冻存3.4肝非实质细胞分离培养

前面已提到，非实质细胞主要就是内皮细胞、星状细胞、库普弗细胞，星状细胞密度较小，平均为1.04g/cm3，一般用尼可登（Nycodenz）密度梯度离心即可，但由于内皮细胞、库普弗细胞密度较为接近，且存在较大的重叠区域，密度梯度离心很难将两都分开，使用离心淘洗法可以得到较纯的细胞。3.4肝非实质细胞分离培养前面已提主要液体配制：1.前灌注液：用不含Ca++、Mg++的D-Hanks溶液配制。内含NaCl137mmol/L，KCl5.4mmol/L，NaH2PO40.5mmol/L，HEPES10mmol/L，用0.1MNaOH调节至PH7.4，过滤除茵。使用前加入无菌肝素125U/ml。2.酶灌注液：用含Ca++的GBSS溶液配制。1升去离子水内加KCl0.37g，MgSO4.7H2O0.07，HaH2PO40.133g，NaHCO30.227g,KH2PO40.03g,MgCl2.6H2O0.21g,HEPES4.8g,glucose1.0g,0.05mmol/LCaCl2.作用前加0.05%胶原酶，10mg/100mlDNAaseI，用0.1MNaOH调至PH7.5，过虑除菌。3.酶消化液：用含Ca++的GBSS溶液配制。内含0.03%胶原酶，10mg/100mlDNaseI，PH7.5过虑除菌4.Nycodenz溶液：根据体积重量比的方法配制。称取适量Nycodenz，溶于90mlGBSS中，搅拌混匀，用GBSS溶液定容至100ml，过虑除菌，4℃保存。5.淘洗液：用RPMI-1640培养基按说明书配制，另加HEPES10mmol/L，青、链霉素各100U/ml，使用前再加1%的胎牛血清。主要液体配制：分离过程1.原位肝脏灌注（鼠为实验对象）麻醉动物--静脉插管--前灌注液--酶灌注液--分离肝脏--酶消化液消化--200目过滤--100g/5min离心两次（收集上清）--500g/7min离心（弃上清）--GBSS或D-Hanks重悬2.分离肝星形细胞（1）用10mlD-Hanks重悬细胞，再加入7ml33%Nycodenz，混匀后再小心在上面再铺一层D-Hanks。（2）1500g离心20min取细胞悬与D-Hanks夹层细胞，DMEM培养液重悬细胞，500g/7min离心两次，计数、接种。分离过程1.原位肝脏灌注（鼠为实验对象）3.离心淘洗法分离内皮细胞、库普弗细胞（1）将18%的Nycodenz溶液与细胞悬液按2：1体积比铺层，最上层再小心铺上一层D-Hanks.（2）4℃1400g离心10min，取中间层液体，D-Hanks稀释，500g7min反复离心洗涤。培养液重悬成10ml。（3）离心淘洗分离。3.离心淘洗法分离内皮细胞、库普弗细胞离心淘洗术原理离心淘洗技术是根据反向流动离心原理设计的。在整个离心淘洗过程中,淘洗室内悬浮液中的细胞受到两个相反方向的力:离心力(离心转速)和向心力(泵控流速)并处于平衡状态。当淘洗室内悬浮液往离心转轴方向流动时，随着淘洗室壁逐渐变宽，悬浮液流速逐渐变慢，这样就形成了一个速度梯度；从离心转轴近端至远端，离心力逐渐增大，也形成一个速度梯度，这两者刚好相反。沉降速度跟细胞大小和密度有关，体积、密度较小的细胞由于沉降速度低先被洗脱出来，较大的细胞由于沉降速度高则滞留在淘洗室入口，这里流速和转速都很高；体积、密度中等的细胞则在淘洗室壁最宽处保持平衡。离心力不变时,通过增加淘洗液的流速可以使体积、密度大的细胞也被淘洗出来。离心淘洗术原理离心淘洗技术是根据反向流动离心原理离心淘洗术原理离心淘洗术原理四、肝干细胞及临床应用肝移植是目前治疗终末期肝病的主要方法，但供肝短缺限制了其应用，导致许多患者未能获得肝移植。近年来，肝细胞的分离鉴定、纯化培养技术日渐成熟，在动物实验和临床研究中均取得了较大进展。四、肝干细胞及临床应用肝移植是目前治肝脏疾病肝脏相关性疾病基因性疾病代谢性缺