重视碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌的检测(孙长贵-兰州)word版本

重视碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌的检测(孙长贵-兰州)一、碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的β-内酰胺类抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。其结构与青霉素类的青霉环相似，不同之处在于噻唑环上的硫原子为碳所替代，且C2与C3之间存在不饱和双键；另外，其6位羟乙基侧链为反式构象。研究证明，正是这个构型特殊的基团，使该类化合物具有超广谱的、极强的抗菌活性，以及对β-内酰胺酶高度的稳定性。2023/1/13解放军第一一七医院检验科22023/1/13解放军第一一七医院检验科3药物研制公司上市年份亚胺培南美国默沙东1985年美罗培南日本住友，英国I-IC1995年厄他培南多利培南美国默沙东日本盐也义公司2002年2005年帕尼培南比阿培南日本三共株式会社Wyeth-lederle实验室1994年2002年碳青霉烯类-种类目前中国上市的碳青霉烯类2023/1/13解放军第一一七医院检验科4国内已经上市的品种有：亚胺培南，美洛培南，帕尼培南，法罗培南，厄他培南，比阿培南。碳青霉烯类作用机制碳青霉烯类抗生素作用方式都是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白（PBPs），从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀致使细菌胞浆渗透压改变和细胞溶解而杀灭细菌。2023/1/13解放军第一一七医院检验科5碳青霉烯类抗菌谱药物链球菌&MSSA肠杆菌科非发酵菌厌氧菌亚胺培南++++美罗培南++++厄他培南++活性有限+多利培南++++2023/1/13解放军第一一七医院检验科6

肠杆菌科细菌对三种碳青霉烯的敏感性中国抗感染化疗杂志2002年3月30日第二卷第一期(3051)(357)(2118)(208)(1143)(22)

非发酵革兰阴性杆菌对三种碳青霉烯的敏感性中国抗感染化疗杂志2002年3月30日第二卷第一期(1790)(169)(1365)(142)(323)如何使用碳青霉烯类?据临床症状使用细菌性脑膜炎医院相关鼻窦炎未知原因败血症医院相关肺炎据临床分离菌株使用不动杆菌铜绿假单胞菌产碱杆菌属肠杆菌科摩根菌.沙雷菌.肠杆菌属.柠檬酸杆菌属.ESBL或AmpC大肠杆菌和克雷伯菌.2023/1/139解放军第一一七医院检验科二、碳青霉烯类耐药机制2023/1/13解放军第一一七医院检验科10二、碳青霉烯类耐药机制2023/1/13解放军第一一七医院检验科11肠杆菌科ESBL或头孢菌素酶+孔蛋白丢失碳青霉烯酶铜绿假单胞菌孔蛋白丢失上调外排泵碳青霉烯酶不动杆菌ESBL或头孢菌素酶+孔蛋白丢失碳青霉烯酶绿脓杆菌的耐药机制

2023/1/13解放军第一一七医院检验科12OprD2OprMMexAMexBPBPsβ-内酰胺酶肽聚糖层细胞膜外膜碱性氨基酸美平美平

亚胺培南帕尼培南?＜菌体外膜通透性模式图＞OprD缺失对碳青霉烯类的影响D2通道缺失所导致的MIC变化（绿脓杆菌）绿脓杆菌外膜通透性示意图对碳青霉烯敏感的绿脓杆菌美平D2通道对碳青霉烯敏感的绿脓菌（PAo2152株）D2通道缺失的绿脓杆菌A（PAo2152株）D2通道缺失的绿脓杆菌B（PAo2152株）帕尼培南亚胺培南美平0.781.563.136.2512.5(mg/ml)SumitaYetal.：Chemotherapy,42,47-56,1996JosephP.Laconisetal.：ClinicalInfectiousDiseases,24（Suppl2）,S191-196,1997AdaptedwithpermissionfromLivermoreDM.ClinInfectDis2002;34:634-640.亚胺培南和美罗培南由此进入美罗培南被泵出细胞外，但亚胺培南不受影响主动泵出系统流出通道(OprM)外膜胞浆周围间隙连接脂蛋白(MexA)胞浆膜流出泵系统(MexB)膜孔蛋白美罗培南被泵出细胞外，但亚胺培南不受影响碳青霉烯酶-内酰胺酶家族中最重要的成员Twomajorgroupsbasedonthehydrolyticmechanismattheactivesite活性部位-丝氨酸:

classA和D活性部位-锌离子:

classB碳青霉烯酶水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类15解放军第一一七医院检验科β-内酰胺酶的结构丝氨酸β-内酰胺酶金属β-内酰胺酶HNOCCHCH2OHH2OZnZnOHH平松啓一編：耐性菌感染症的理論与実際,1998碳青霉烯酶分类2023/1/13解放军第一一七医院检验科17分类

代表酶最常见细菌ClassAKPC,SME,IMI,NMC,GES肠杆菌科(铜绿假单胞菌罕见报告)ClassB(金属-b-内酰胺酶)IMP,VIM,GIM,SPM，NDM-1铜绿假单胞菌肠杆菌科不动杆菌ClassDOXA23,-40,-51,-58不动杆菌KPC

酶

位于质粒上；接合和

非接合blaKPC

可水平传播blaKPC

可与介导其他耐药的基因共同存在:广谱b-内酰胺酶超广谱b-内酰胺酶氨基糖苷类耐药氟喹诺酮类耐药leadstoextensive-drugresistance(XDR)亚型：KPC-1~KPC-122023/1/1318解放军第一一七医院检验科NDM-1酶已有研究结果表明编码NDM-1酶基因主要位于质粒上，质粒大小可不同（肺炎克雷伯菌180kb质粒，大肠埃希菌140kb质粒），提示blaNDM-1基因可在菌株间转移和传播。少数分离菌blaNDM-1基因位于染色体上。blaNDM-1基因编码区GC含量（57%）比周围DNA序列（62%~65%）低，表明其是外源转移获得的新DNA片段。基因全长826bp。NDM-1酶分子量为28kDa，等电点（pI）6.9。解放军第一一七医院检验科2023/1/1319三、产碳青霉烯酶菌株流行与分布2023/1/13解放军第一一七医院检验科20碳青霉烯酶在临床菌株中流行2023/1/13解放军第一一七医院检验科21酶类细菌KPC肠杆菌科金属-b-内酰胺酶(IMP,VIM)铜绿假单胞菌OXA不动杆菌SME粘质沙雷菌肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)KPC是A类

b-内酰胺酶赋予细菌对所有b-内酰胺类包括超广谱头孢菌素类和碳青霉烯类

耐药。出现于肠杆菌科菌最常见于肺炎克雷伯菌。1996年在美国发现，2001年报道。也在下列菌中发现:产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆菌属、大肠埃希菌、沙门菌和沙雷菌。

在铜绿假单胞菌中也有报道(南美)2023/1/1322解放军第一一七医院检验科产KPC肺炎克雷伯菌敏感谱抗菌药物结果解释抗菌药物结果解释阿米卡星I氯霉素R阿莫西林/clavR环丙沙星R氨苄西林R厄他培南R氨曲南R庆大霉素R头孢唑啉R亚胺培南R头孢泊肟R美罗培南R头孢噻肟R哌拉西林/TazoR头孢替坦R妥布霉素R头孢西丁R复方新诺明R头孢他啶R多粘菌素BMIC>4mg/ml头孢曲松R黏菌素MIC>4mg/ml头孢吡肟R替甲环素S美国产KPC菌株地理分布经常发生散发的2023/1/1324解放军第一一七医院检验科美国以外KPC分布法国

(Nassetal.2005.AAC49:4423-4424)新加坡

(reportfromsurvey)波多黎各

(ICAAC2007)哥伦比亚

(Villegasetal.2006.AAC50:2880-2882&ICAAC07)巴西

(ICAAC2007)以色列(Navon-Veneziaetal.2006.AAC50:3098-3101)中国

(WeiZ,etal.2007.AAC51:763-765)其他国家和地区2023/1/1325解放军第一一七医院检验科2023/1/13解放军第一一七医院检验科26美国以外KPC分布NormanPetal.LID2009K.Pneumoniaewithcarbapenemase-producingclones27Dr.T.V.RaoMD其他型碳青霉烯酶分布2023/1/13解放军第一一七医院检验科28四、实验室检测2023/1/13解放军第一一七医院检验科29四、实验室检测由碳青霉烯酶介导的耐药，在临床实验室可通过常规表型试验方法来检测，包括纸片扩散法和改良Hodge试验。最终鉴定需检测耐药基因来进行确认。2023/1/13解放军第一一七医院检验科30表型检测－纸片扩散、

MIC

&Etest2023/1/1331解放军第一一七医院检验科CLSI推荐解释标准M100文件表型检测－纸片扩散法

药物CLSIM100-S19CLSIM100-S23SIRSIR多利培南－－－≥2320-22≤19厄他培南≥1916-18≤15≥2320-22≤19亚胺培南≥1614-15≤13≥2320-22≤19美罗培南≥1614-15≤13≥2320-22≤19解放军第一一七医院检验科表型检测－MIC法2023/1/13解放军第一一七医院检验科33药物CLSIM100-S19CLSIM100-S23SIRSIR多利培南－－－≤12≥4厄他培南≤24≥8≤0.250.5≥1亚胺培南≤48≥16≤12≥4美罗培南≤48≥16≤12≥4耐药酶表型检测2023/1/13解放军第一一七医院检验科34KPC-产生菌实验室检测：问题:1、某些分离菌株被证明低水平对碳青霉烯类耐药2、某些自动化系统缺泛检测低水平碳青霉烯类耐药的能力。碳青霉烯酶表型试验改良Hodge试验（ModifiedHodgeTest）100%sensitivityindetectingKPC;alsopositivewhenothercarbapenemasesarepresent100%specificityProceduredescribedbyLeeetal.CMI,7,88-102.2001.2023/1/1335解放军第一一七医院检验科ModifiedHodgeTestLawnofE.coliATCC259221:10dilutionofa0.5McFarlandsuspensionImipenemdiskTestisolatesDescribedbyLeeetal.CMI,7,88-102.2001.36解放军第一一七医院检验科37双纸片协同试验－金属酶解放军第一一七医院检验科2023/1/1338双纸片增效试验解放军第一一七医院检验科2023/1/1339KPC、NDM-1等酶产生菌最终确定PCR检测耐药基因确认方法402023/1/13解放军第一一七医院检验科412023/1/13解放军第一一七医院检验科42测序结果判读测序彩图：峰体清晰、无套峰2023/1/1343序列比对2023/1/13解放军第一一七医院检验科44测序结果经BLAST与基因数据为中已知序列比对分析，最终确定基因型。/nuccore产KPC菌株治疗替加环素(100.0%有效)黏菌素(88.1%有效)SENTRYreport.AAC.2008.Feb;52(2):570-3米诺环素

根据药敏试验选择解放军第一一七医院检验科45新德里金属-ß-内酰胺酶（NDM-1)2023/1/1346解放军第一一七医院检验科Firstreportedin2009frompatientwho

traveledtoIndiaAdditional183isolatesreportedin2010fromIndia,Pakistan,U.K.,andU.S.-K.pneumoniae,E.coli,Enterobacter,

Proteus,CitrobacterNDM-1carriedonplasmidsofvarious

sizesYong,AAC53:5046,2009;Kumarasamy,Lancet3099,2010;Patel,2010NDM-1实验室检测：常规药敏试验方法分子生物学方法2023/1/1347解放军第一一七医院检验科NDM-1基因确证

采用blaNDM-1基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带blaNDM-1基因。引物一：上游5′-ACCGCCTGGACCGATGACCA-3′

下游5′-GCCAAAGTTGGGCGCGGTTG-3′引物二：上游5′-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3′下游5′-CGCAACACAGCCTGACTTTC-3′解放军第一一七医院检验科2023/1/1348引物引物序列（5＇→3＇）产物大小（bp）退火温度(℃)引物117U-191CAGCAC