分子生物学课件

分子生物学课件第1页/共49页3，顺式作用序列（cis-actingsequence）4，顺式作用第2页/共49页二、正、负控制系统对操纵元的控制（一）可诱导操纵元及可阻遏操纵元1，可诱导操纵元(incucibleoperon)（1）可诱导操纵元的定义（2）诱导（induction）（3）诱导物（inducer）第3页/共49页2，可阻遏操纵元（repressibleoperon）（1）可阻遏操纵元的定义（2）阻遏（repression）（3）辅阻遏物（corepressor）第4页/共49页（二）操纵元的状态1，转录活性开放2，转录活性关闭3，正、负控制操纵元的状态（图8－1）负控制操纵元的诱导和阻遏正控制操纵元的诱导和阻遏不可诱导/超阻遏组成型表达第5页/共49页（三）正、负控制系统的遗传学特征1，负控制系统的特征2，正控制系统的特征第6页/共49页第二节

操纵元的原型——

乳糖操纵元一、操纵元模型的提出（一）酶的诱导及阻遏现1，细菌半乳糖苷酶合成的诱导2，细菌色氨酸合成酶合成的阻遏3，安慰诱导物第7页/共49页（二）大肠杆菌乳糖代谢系统1，乳糖代谢相关酶及其基因（1）乳糖代谢相关酶（2）lacZYA基因第8页/共49页2，lacZYA系统的突变体研究

（1）部分二倍体（partialdiploid）（2）lacO的作用为顺式作用（3）lacI的作用为反式作用（4）不可诱导的突变（不论有无诱导物均不能合成Lac酶系统）lacIS突变lacP突变第9页/共49页（三）操纵元模型1，Jacob-Monod操纵元模型（1）操纵元的结构（2）操纵元各组分的作用2，操纵元的完整概念第10页/共49页二、乳糖操纵元的调控机理（一）lac操纵元1，lac操纵元的结构2，lac操纵元的调控第11页/共49页（二）lac操纵元的本底组成型合成1，原因一2，原因二（三）半乳糖苷酶的作用（图8-4）第12页/共49页三、阻遏蛋白与操作子的相互作用（一）操作子上与阻遏蛋白结合的位点1，lacI基因的表达特点低效率组成型第13页/共49页2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋白的结合（1）阻遏蛋白与lacO结合的实验证据可以分离到阻遏蛋白与lacO结合的复合物这种结合可被IPTG所抑制lacOcDNA片段不能与阻遏蛋白结合第14页/共49页（2）lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构A，DNA内切核酸酶消化实验证明：受阻遏蛋白保护区域位于-5~+21(26bp)B，阻遏蛋白保护位点：甲基化实验确认被保护的嘌呤紫外交联实验确认被保护的胸腺嘧啶第15页/共49页第16页/共49页C，lacO

的结构及其与阻遏蛋白的结合性质lacODNA序列的对称性：以+11为对称轴，两侧为两段各6bp的对称序列第17页/共49页第18页/共49页与阻遏蛋白的结合位点主要位于近轴对称序列：+3~19的嘌呤、+1~+22的多数胸腺嘧啶与RNA聚合酶接触lacO组成型突变位点大多位于左侧第19页/共49页第20页/共49页左侧序列与阻遏蛋白结合的亲和力高3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响（1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合（2）阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力（RNA聚合酶与的平衡常数从1.9*107增加到2.5*109）第21页/共49页（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物，阻止转录的起始（4）阻遏蛋白的这种作用对操纵元的诱导也有促进意义阻遏蛋白的存在促进RNA聚合酶与启动子结合一旦加入诱导物，阻遏蛋白总体上将加快诱导过程第22页/共49页（4）上述模式不一定适用于其他系统原因一：RNA聚合酶、阻遏蛋白、启动子/操作子之间的相互作用不同原因二：不同系统中操作子与启动子的相对位置不一致第23页/共49页（二）阻遏蛋白上与操作子结合的位点1，阻遏蛋白单体的结构用胰蛋白酶消化阻遏蛋白单体可得到（1）长头片段（longheadpiece），由1-59位Aa残基构成，有与操作子结合的能力。短头片段核心片段长头片段抗胰蛋白酶核心铰链区051-528159-60360第24页/共49页（2）短头片段胰蛋白酶还可将长头片段切割为短头片段（1-51位Aa残基）由螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）结构构成两个螺旋嵌入DNA的大沟中，与特定的碱基结合。这个区域通过一个铰链区与蛋白质的主体相连短头片段核心片段长头片段抗胰蛋白酶核心铰链区051-528159-60360第25页/共49页（3）核心片段（core）具有形成四聚体及与诱导物结合的能力由两个相似的结构域组成，每个区域的两端有两个α螺旋，螺旋之间是6股平行β折叠。诱导物结合在两个区域之间的一个裂隙之中C末端是一个向外伸出的α螺旋，由两组7个亮氨酸的重复序列构成。第26页/共49页（4）铰链区由52-80位Aa残基构成当阻遏蛋白以DNA结合形式存在时，铰链形成一个小的α螺旋；当阻遏蛋白不与DNA结合时，该区域是无序的。第27页/共49页2，阻遏蛋白四聚体的结构四个阻遏蛋白单体的C末端螺旋相互结合，维持四聚体的结构第28页/共49页二聚体的两个单体核心片段的N-端之间的有一个疏松的界面，一个供诱导物结合的裂隙，和一个疏水核心第29页/共49页3，阻遏蛋白与操作子的结合阻遏蛋白以头部片段与操作子DNA结合。第30页/共49页头部片段可独立于核心片段与操作子结合，但其亲和力比完整的阻遏蛋白低许多个数量级。因为完整的阻遏蛋白可以以两个头部片段同时与操作子结合，这将极大地提高与操作子的亲和力第31页/共49页4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用（1）lac系统存在多个操作子O1：位于lacZ基因起始位点，与阻遏蛋白亲和力最高O2：位于起始位点下游410bpO3：位于O1上游83bp第32页/共49页（2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合阻遏蛋白同时与O1和O2或O3之一结合，使两个操作子之间的DNA形成环状结构。第33页/共49页（3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻遏的水平去除O2或O3，阻遏效率降低2-4倍去除O2、O3，阻遏效率降低100倍。第34页/共49页（三）阻遏蛋白与操作子的解离1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结合的证据阻遏蛋白与操作子的结合很稳定，而诱导作用很快实验证明，诱导物是可以与结合在操作子上的阻遏蛋白结合的第35页/共49页2，诱导物与阻遏蛋白的结合立即改变阻遏蛋白的构象，使头部片段与核心片段的相对方向改变，导致阻遏蛋白二聚体的头部片段不再同时与DNA结合，从而降低操作子与阻遏蛋白结合的亲和力第36页/共49页3，阻遏蛋白与不同DNA的结合（1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结合的特异性DNA阻遏蛋白（结合常数）阻遏蛋白+诱导物（结合常数）操作子2×10132×1010其他DNA2×1062×106特异性107104第37页/共49页（2）细胞内阻遏蛋白的结合位点阻遏蛋白的高亲和力（特异性）结合位点：一个（lacO）阻遏蛋白的底亲和力（非特异性）结合位点：4.2×106第38页/共49页（3）细胞内阻遏蛋白的存在方式无诱导物存在时：一个阻遏蛋白与lacO结合，其余阻遏蛋白全部随机结合在其他DNA序列上有诱导物存在时：阻遏蛋白全部随机结合在其他DNA序列上第39页/共49页第40页/共49页（四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用的突变体1，i-突变体（1）突变的分子效应：不能形成二聚体或四聚体，或形成四聚体却不能和DNA结合第41页/共49页（2）突变位点：不能形成四聚体的突变位于220~280残基之间，其他突变分布于整个核心片段（3）突变表型：隐性/组成型第42页/共49页2，iS突变体（1）突变的分子效应：不能与诱导物结合，或与诱导物结合后不能产生别构效应（2）突变位点：分布于62~300个Aa残基之间，190~300较集中，呈26个残基的周期性（3）突变表型：显性/超阻遏第43页/共49页3，it突变体（1）突变的分子效应：阻遏蛋白与lacO紧密结合（2）突变位点：分布于50个Aa残基的头部片段中（3）突变表型：显性/不可诱导第44页/共49页4，i-d突变体（1）突变的分子效应：lacI基因的等位基因互补等位基因互补：当多亚基蛋白质由不同等位基因编码的亚基构成时，异源多聚体蛋白质的性质发生改变，杂合蛋白质的活性不同与任何一种同源多聚体蛋