基因工程概述

基因工程概述第1页/共48页证明DNA是遗传物质发现DNA双螺旋结构破译遗传密码限制性核酸内切酶的发现DNA连接酶的发现逆转录酶的发现质粒等载体的发现基因工程的诞生1944，艾弗里1953，沃森和克里克1963，尼伦贝格1970，阿尔伯、内森斯、史密斯第2页/共48页基因工程的诞生1973年，美国科学家科恩（S.N.Cohen）等将两种不同来源的DNA分子进行体外重组,并首次实现了在大肠杆菌中的表达,创立了定向改造生物的新技术—基因工程。第3页/共48页1973年，科恩和博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。第4页/共48页基因工程大事记1973年，体外重组的基因首次实现在大肠杆菌中的表达1977年，生长激素抑制素在大肠杆菌中成功表达1978年，人胰岛素在大肠杆菌中成功合成1979年，人生长激素在大肠杆菌中得以表达1980年，人干扰素在大肠杆菌中成功表达1982年，巨型小鼠培育成功第5页/共48页基因工程的工具—酶与载体分子手术刀——限制性核酸内切酶。分子针线（分子缝合针）—DNA连接酶。基因的运输工具（分子运输车）—载体。第6页/共48页限制性核酸内切酶

限制性内切酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。

即每种限制性内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。特点：特异性。举例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶第7页/共48页不同的限制性核酸内切酶知识海洋平(口)末端回文序列第8页/共48页要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。第9页/共48页AAT

GAATTC

GATGATTCCGTAAT

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第10页/共48页DNA连接酶（DNAligase）同一种第11页/共48页连接的部位：

用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？磷酸二酯键，不是氢键。第12页/共48页连接酶的种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶第13页/共48页14第14页/共48页外源基因(如大鼠生长激素基因)怎样才能导入受体细胞(如小鼠受精卵)？导入过程需要运输工具——载体。载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。作用二：利用载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。第15页/共48页作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。载体第16页/共48页常用的载体主要有两类：

1）细菌细胞质的质粒

2）噬菌体或某些动植物病毒第17页/共48页质粒的特点细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；质粒是基因工程中最早应用也是最常用的载体；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在对宿主细胞的生存无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。第18页/共48页

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素等标记基因。最简单的质粒载体必需包括3部分：复制区（含复制原点）目的基因插入点遗传标记基因第19页/共48页第20页/共48页1.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是（）

A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B.限制性核酸内切酶的活性受温度的影响

C.限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD.限制性核酸内切酶可从原核生物中提取

C反馈练习第21页/共48页2.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（）

A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键

B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键

C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键

D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接B第22页/共48页3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是（）

供体剪刀针线载体受体A质粒限制性核酸内切酶DNA连接酶提供目的基因的生物大肠杆菌等B提供目的基因的生物DNA连接酶限制性核酸内切酶质粒大肠杆菌等C提供目的基因的生物限制性核酸内切酶DNA连接酶质粒大肠杆菌等D大肠杆菌等DNA连接酶限制性核酸内切酶提供目的基因的生物质粒C第23页/共48页4第24页/共48页5第25页/共48页26第26页/共48页第27页/共48页基因工程的一般步骤获得目的基因（目的基因的获取）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞)（筛选出获得目的基因的受体细胞、培养重组细胞）4.目的基因的表达（目的基因的检测和鉴定）第28页/共48页第一步：获取目的基因

方法：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（genelibrary）基因组文库cDNA文库1.从基因文库中获取目的基因。第29页/共48页第30页/共48页2.利用PCR技术扩增目的基因

PCR（polymerasechainreaction）:聚合酶链式反应.是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的.1988，K.Mulllis莫里斯发明。前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。

3.通过化学方法直接人工合成

高温变性低温退火(复性)中温延伸第31页/共48页第二步：制备重组DNA分子

（基因表达载体的构建）核心限制性核酸内切酶需要哪两种工具？DNA连接酶第32页/共48页总结：表达载体需由哪几部分组成复制原点启动子目的基因终止子标记基因第33页/共48页第三步：转化受体细胞

（将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化（ruansformation）第34页/共48页将目的基因导入植物细胞的方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法第35页/共48页将目的基因导入微生物细胞方法宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞（大肠杆菌）Ca2+第36页/共48页基因工程中常用的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、霉菌、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞等。将目的基因导入受体细胞扩增第37页/共48页第四步：目的基因的检测与鉴定首先：其次：最后：还要：要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子杂交技术分子探针检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平的鉴定第38页/共48页DNA分子杂交技术基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。第39页/共48页1.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（）

A.重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切酶、连接酶和载体

B.所有的限制性核酸内切酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列

C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达反馈练习第40页/共48页2第41页/共48页第42页/共48页第43页/共48页3．（2010江苏高考，27题，8分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有

个游离的磷酸基团。0、2

第44页/共48页（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越

。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。（4）与只使用EcoRI相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止

。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入

酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了

。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在