基因的体外重组和转化

基因的体外重组和转化第1页/共56页连接方式：

黏性末端的连接平头末端的连接修饰黏性末端的连接

PCR产物的连接

Gateway载体构建体系第2页/共56页一、黏性末端的连接

黏性末端连接(Cohesiveendligation)：具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链DNA。

第3页/共56页1.同种酶产生的黏末端的连接第4页/共56页优点经济省时，操作方便；外源片段容易回收；第5页/共56页问题载体自身环化插入片段可双向插入第6页/共56页第7页/共56页2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点第8页/共56页载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点第9页/共56页无相同的限制酶识别位点，有同尾酶

SalⅠ片段（CAGCTG）XhoⅠ片段(GAGCTC)G3’CAGCT5’C3’GAGCT5’DNA连接酶讨论：

连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？？第10页/共56页若均不是以上情况呢？第11页/共56页二、平末端的连接

平末端连接(bluntendligation)：在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。第12页/共56页平端连接

AGCT

TCGAAluⅠT4DNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGA第13页/共56页优点可以用T4连接酶连接任何DNA平端

第14页/共56页5’-突出粘性末端的补齐

可用Klenow聚合酶补齐3’-突出粘性末端的削平

可用T4DNA聚合酶削平

第15页/共56页第16页/共56页主要问题连接效率低高浓度的底物和T4DNA连接酶添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源DNA片断双向插入第17页/共56页三、修饰黏末端连接同聚物加尾法：同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端,然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。第18页/共56页第19页/共56页优点①不会发生自身环化作用；②连接效率较高；第20页/共56页存在问题操作繁琐外源片段难回收可能会影响基因表达第21页/共56页衔接物连接法衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由8～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。第22页/共56页第23页/共56页DNA接头法：

DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。第24页/共56页人工接头连接BamHIBamHIBamHI第25页/共56页讨论如何将一平末端的DNA片段与BamHⅠ形成的粘性末端连接？（P156.4）第26页/共56页四、PCR产物的连接1.限制性内切酶酶切位点引入法在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。第27页/共56页（1）在引物上添加酶切位点第28页/共56页第29页/共56页！！注意①添加保护序列Primer1:5'

GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5‘

GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC②引入的酶切位点是单一的第30页/共56页（2）利用突变在引物5‘端引入酶切位点通过在PCR引物序列的5’端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。第31页/共56页2.T-A克隆利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.3′5′T载体3′5′载体T3′5′3′5′AAPCR产物第32页/共56页Taq酶PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选

目的片段第33页/共56页T载体的构建：

用限制性内切酶如XcmI,HphI,与MobII酶切产生3‘末端未配对的T；应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。应用不依赖末端的TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。第34页/共56页五、Gateway载体构建系统Gateway技术：一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（EntryVector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（DestinationVector，目的载体）上。第35页/共56页Gateway技术的灵活性：第36页/共56页整合后的附着位点为

attL（BOP’）

attR（POB’）整合位点---attBattP

切除位点---attLattR整合过程需要介导蛋白和重组位点。第37页/共56页第二节、重组体导入细菌细胞转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒DNA的生命过程；转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体DNA的生命过程；转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。第38页/共56页重组体的转化受体细胞重组体的转化第39页/共56页受体细胞的选择（1）具有接受外源DNA的能力；（2）限制酶缺陷型；（3）DNA重组缺陷型；（4）不适于在人体内或非培养条件下生存；（5）它的DNA不易转移。第40页/共56页一、大肠杆菌感受态的制备

感受态：细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态就称为感受态。第41页/共56页

1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA。此后不久，Cohen等人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：第42页/共56页将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入DNA，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。第43页/共56页CaCl2处理受体细菌CaCl2

感受态细菌重组体转入细菌第44页/共56页二、重组DNA导入大肠杆菌第45页/共56页

重组DNA转移到大肠杆菌细胞内的过程1.吸附：双链DNA分子吸附在受体菌表面2.转入：双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；3.自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状；4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。第46页/共56页JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态第47页/共56页转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照——10ulPBR322DNA100ul

1b阴性对照①10ul——2ul连接液100ul

2c阴性对照②——10ul——100ul

3d连接液转化组——60ul6ul连接液600ul

4具体操作：冰浴30’；42℃2’；冰浴2’；加37℃预热LB培养45’；表中a、b、c各取100ul/皿涂布，连接液转化组d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul浓缩后2皿）37℃倒置培养过夜；检查细菌生长情况。第48页/共56页转化率：转化细胞/细胞总数

影响因素：细胞生长状态和密度

质粒的质量和浓度试剂的质量杂菌和杂DNA的污染

第49页/共56页思考题：试述DNA片段的体外连接方式？第50页/共56页练习题：打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E．coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它从BamH[的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5’磷酸；接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。第51页/共56页实验中同时设置了4个对照：对照1：将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；对照2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；对照3：将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上；对照4：将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。第52页/共56页

在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。第53页/共56页cDNA克隆的结果

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实验结果制备的样品123

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对照1只有细胞TMTC00

对照2未切的载体TMTC0>1000

对照3省去磷酸酶处理，无cDNATMTC0435

对照4无cDNATMTC025

实验样品