体外放射分析-1 总论教材课件

体外放射分析InvitroRadioassay蔡华伟四川大学华西医院核医学科Page

2常见临床待测物质浓度与检测手段100g/L10-310-6mg/Lug/Lng/Lpg/L10-910-12超微量微量常量临床化学分析体外放射分析血清蛋白血药浓度甲状腺激素生殖激素过敏原肿瘤标志物传染病疾病原维生素Page

3放免实验室——838个PET/CT——198台SPECT/CT——659台核医学与体外分析Page

4第一节

体外放射分析总论Page

5体外分析发展史1950年美国免疫学家Perssmen使用放射性碘标记抗原研究了抗原- 抗体免疫反应；1959年美国生物学家Yalow和Berson建立了放射免疫分析法（RIA）;1960年英国Ekins建立了甲状腺激素的竞争蛋白结合分析法（CPBA）;1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析法（IRMA）;1970年Lefkowitz建立了受体的放射配基结合分析法（RBA）;1983年Soini和Kojola建立了时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）;Page

6Dr.Yalow历史背景Dr.Berson一、体外分析技术的理论基础可逆结合反应，遵守可逆反应的质量作用定律： k1，v1 [L]+[B] [L.B] k2,v2

K1=B、L正向结合为L.B复合物的速率常数；

K2=L.B复合物离解为L和B的速率常数；L，配体；B，结合体；L.B，配体/结合体复合物K1在早期明显，K2在后期明显，一定时间后达到平衡状态，两者保持相对恒定，但K1>K2。K1与K2之比为亲和力常数Ka（Kvalueofaffinity），Ka=K1/K2。K2与K1之比为平衡离解常数Kd（Kvalueofdissociation），Kd=K2/K1。Page

8体外分析技术的生物学基础特异性结合反应：

抗原-抗体的免疫结合反应

配体-受体的结合反应

底物-催化酶之间的酶促反应激素-亲和蛋白的结合反应

结合配对：

抗原-抗体

配体-受体

底物-催化酶

激素-激素结合球蛋白

体外分析技术的定量手段

放射性测量酶定量化学发光定量技术

体外分析技术体外放射分析体外非放射分析放射性竞争结合分析放射性非竞争结合分析放射免疫分析

(radioimmunoassay,RIA)竞争蛋白结合分析(Competitiveprotein

bindingassay，CPBA)受体的放射性配基结合分析（Radioligandbindingassayofreceptor,RBA）免疫放射分析(immunoradiometricassay,

IRMA)酶免疫分析(EIA)化学发光免疫分析

(CLIA)电化学发光免疫分析（ECL）

荧光免疫分析(FIA)二、体外分析技术的分类定义：以放射性标记的配体（Ligand）为示踪剂，以配体和结合体的特异性结合反应为基础，以放射性测定为定量依据，在体外实验条件下，对超微量物质进行定量检测的一类技术的总称。三、体外放射分析技术灵敏度高可达10-15g/L特异性强样品(如血清）不必分离提纯操作简单应用范围广体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，它的主要特点是：体外放射分析技术的特点Page

13分类：放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、蛋白质竞争结合分析等。其中以放射免疫分析(RIA)和免疫放射分析(IRMA)应用最为普遍。不仅可用于样品中蛋白质、多肽、甾体类激素等物质的测量，而且可用于具有生物活性的小分子物质的检测，如血药浓度测定等。体外放射分析法的分类及应用Page

14第二节

体外放射分析的基本方法Page

15一.试剂的制备二.纯化抗原/抗体的放射性标记三.放射性抗原抗体复合物的分离四.标准曲线的建立体外放射分析的基本环节（四要素）Page

161.非标记标准抗原/免疫原（标准品）2.特异性抗体Ab3.标记抗原*Ag一.体外放射分析的基本试剂以RIA为例：定义：标准品是呈一定浓度梯度且准确定量的一组未标记的抗原/免疫原，是待测样品的定量标准和标准曲线的绘制依据。标准品抗原/免疫原标准品

抗原——能和特异性专一性抗体结合的物质，包括半抗原

半抗原——能与抗体结合，但不能诱发免疫反应

免疫原——能引起主动免疫反应的抗原

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19与待测抗原应属于同一种物质，其分子结构，构型，抗原决定簇以及抗体亲和力等均相同；高度纯化，尽可能不含影响分析的干扰物；定量准确抗原/免疫原标准品的必备特点化学标准品一般分子量较小，结构清楚，可以用人工合成或用普通物理化学方法进行鉴定。生物标准品一般是比较复杂的生物大分子，多数只能从生物制品中提取，其结构很难测定，用重量或生物单位表示。无论何种标准品，其纯度皆要求很高，而纯化过程复杂。保证标准品合理的贮存条件很重要。

在放射免疫分析系统中，抗体质量的好坏是影响放射免疫分析灵敏度和准确性的关键因素之一，一个高质量的抗体要满足以下几点要求：2.特异抗体高特异性(Specificity)；高亲和力(Affinityconstant)；高滴度(Titer)。免疫原的选择与强化免疫动物的选择免疫原的剂量选择免疫反应持续时间的选择抗体的制备Page

23免疫原的选择免疫原的分子量与免疫原性通常呈正相关免疫原的乳化：保护免疫原，延长吸收周期佐剂的使用：激发并强化动物对免疫原的免疫反应。

增加抗原表面积，易于被巨噬细胞吸收；延长抗原存留期，增加免疫反应发生几率；诱发局部淋巴结炎症反应，促进免疫细胞增殖。Page

24免疫动物的选择对抗原的反应性好，易产生高亲和力抗体来源容易，价格便宜足够数量的免疫动物以便后续高滴度抗体筛选免疫原的注射：背部皮内，足垫，淋巴结，腹腔，脾脏。加强免疫应在初次免疫部位附近完成二次注射。Page

25免疫原剂量及免疫时间的确定免疫原使用一般在0.6–1.6mg/kg体重加强免疫可4–6周一次末次免疫后10天左右可开始试血鉴定抗体的亲和力常随免疫时间延长而增加，但抗体对抗原类似物的交叉反应也可能增加。Page

26在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，用具备这种特性的单个杂交瘤细胞用于体外培养或接种动物获得具有高效价的和能识别单一抗原决定簇的抗体，称单克隆抗体。单克隆抗体的使用放射免疫分析的灵敏度度和特异性得到大大提高。单克隆抗体（mAb）技术Page

27单克隆抗体的制备免疫动物细胞融合选择性培养杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆单克隆抗体的大量制备：体外培养与体内诱生Page

28抗体的质量控制特异性测定(Specificity)；亲和力测定(Affinityconstant)；滴度测定(Titer)。

标记抗原是放射免疫的测量依据，一个好的标记抗原对测量结果的准确度及灵敏度具有重要意义。二.抗原/抗体的放射性标记高放射性比度和高放化纯度（>95%）；与标记前的抗原具有相同的生物特性和免疫活性；标记用放射性核素具有适宜的半衰期；放射性核素在标记抗原上具有良好的稳定性。

常用于临床放免分析的核素主要有125I,3H,14C等。Page

30（1）同位标记：14C和3H，即用被标记物分子中所含元素的同位素来替代原有的元素。（2）非同位标记：125I、131I等。

放射性核素的选择14C和3H标记125I标记对标记物结构影响替代已有的C或H，对标记物质结构无影响在标记物质上使用I原子替代H原子，可能影响其免疫活性标记难度高低标记物比活性低高标记物稳定性较差较好标记物半衰期很长（>3年）适中（~60天）发射射线β射线γ射线检测手段液体闪烁计数器井型闪烁计数器

125I标记方法原理：利用酪氨酸的“嗜碘性”，即酪氨酸芳香环上羟基邻位的两个氢原子很容易被碘取代的特性，采用适当的氧化剂将负离子形式的I-氧化成分子状态或正离子状态，再发生碘代反应，通式为：HO—-CH2CHCO－R

+

125I2HO—-CH2CHCO－RNH2NH2125I125I（1）放射化学纯度测定检测特定化学形态的标记物的比例，排除标记物中杂质的干扰。标记抗原的性能鉴定标记抗原中的杂质：原料化合物中原有杂质被碘化；标记过程中产生的放射化学杂质；放射性碘中的杂质；标记反应中的伴生标记物，如双碘标记物。Page

33125I-Ag（I2）(I-)活性炭吸附法，过量抗体结合法，纸层析和薄板层析法，电泳法，三氯醋酸沉淀法纸层析法检测抗原的标记率Page

34（2）免疫活性测定，即检测标记抗原与抗体间的亲和力。放化纯度好不等于免疫活性好。免疫活性受损的影响因素：在蛋白分子中引入碘原子代替氢原子；辐射损伤：碘化反应时的氧化还原反应；孵育损伤，标记物的聚合及脱碘等贮存损伤。（3）放射性比活度

根据投料、收集产物放射性总计数和仪器的探测效率即可计算。Page

36三、影响放射体外分析反应的因素理想的反应条件一般可由下列环节调整得到：1.缓冲液：不同缓冲液得到的标准曲线可能有所不同。常用缓冲液pH多为7.0~8.5，离子浓度多为0.01~0.1M。2.温度和时间：4℃可使抗原抗体结合率最大化；37℃可使结合反应最快达到平衡。3.添加剂：保持待测物活性，维持反应稳定等目的。4.非平衡反应法：当平衡法的灵敏度达不到要求时可才选用非平衡法，灵敏度可提高5–10倍。四、放射体外分析中的分离技术理想的分离技术应具备以下几点要素：1.将B与F尽可能完全分离，且不会改变反应体系的最初平衡状态，也不会导致抗原抗体复合物解离或形成新的复合物；2.B与F的分离不易受杂质与环境因素（如温度，pH值等）影响；3.分离方法操作简单快速，分离试剂来源丰富，价廉易得，分离结果重复性好。放射免疫分析中的分离技术目前主要的分离方法有：双抗体沉淀法；PEG沉淀法；双抗+PEG法；固相抗体法；其他方法（生物分离法，活性碳吸附法，

微孔过滤法，电泳法等）双抗体分离技术优点：B和F分离较完全，重复性好，非特异性结合低缺点：分离时间长，第二抗体用量较大且易受反应介质

中蛋白质及盐含量影响。

PEG沉淀分离技术PEG沉淀法的原理，是利用蛋白质分子处在等电点环境中时易沉淀的特点，使用盐或有机溶剂来破坏蛋白质分子表面的水化层来使蛋白质沉淀。PEG是一种直链大分子聚合物，一般认为，PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定法和循环免疫复合物测定法。优点：PEG价格低廉，操作简便，分离速度快。缺点：PEG单独使用时非特异结合较高，分离效果易受 pH值，温度及脂类影响。双抗体+PEG沉淀分离技术

目前应用最为广泛的方法之一，兼具了双抗体分离法特异性强，非特异结合低的优点，也具备PEG沉淀法分离速度快，价格低廉的特色，是当前分离技术中较为理想的方法。优点：特异性高，非特异性结合少，分离速度快，既适用于蛋白质、酶、大分子物质，同时也适用于小分子肽等半抗原物质。金黄色葡萄球菌A蛋白分离技术金黄色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合。出现共沉反应的SPA与IgG必须有两个结合部位，它们分别在Fc和Fab段上,缺一虽能与SPA结合，但不出现共沉反应。SPA菌对各类免疫球蛋