蔗糖酶分离提纯与酶促

蔗糖酶分离提纯与酶促2023/3/202

内容提示

本实验含如下内容（1、2、3是酶分离提纯及比活力测定部分的内容；4、5是酶促反应动力学部分的内容）：1、3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的制作及三种蔗糖酶样品（E1、E2、E3）的测定（酶活力）；2、Folin-糖酶样品（E1、E2、E3）的测定（蛋白质含量）；3、蔗糖酶的分离提纯（细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和柱层析—装柱、上样、洗柱、洗脱、收集酶活力峰、保存）；4、蔗糖酶米氏常数的测定（用双倒数法）；5、用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响（含实验设计及数据处理的相关知识）。2023/3/203

一、目的要求

1.熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项；2.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理和方法；3.学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4.学习酶蛋白分离提纯的原理；5.学习掌握细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析技术；

6.学习掌握酶的比活力测定及其计算方法；7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择确定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。2023/3/204

二、实验原理

前言酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离;胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。酶促反应的动力学（反应速度及影响因素）:1）底物浓度对酶促反应速度的影响2）酶浓度对酶促反应速度的影响3）pH值对酶促反应速度的影响4）温度对酶促反应速度的影响5）激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响.2023/3/2052023/3/2062023/3/2072023/3/2084、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理：

1）凡含有两个及两个以上肽键（—CO—NH—）的化合物（如双缩脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；

2）蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物；

3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比；在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。2023/3/2095、有机溶剂分级沉淀的原理：有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。其原理是：

1）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加Pr分子上不同电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降；

2）有机溶剂与水作用，能破坏Pr的水化膜，使蛋白质的溶解度下降。6、离子交换柱层析的原理：是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导；在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：2023/3/20101）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr

的吸附容量大；2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对

Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起Pr的变性；3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。本实验中使用的DEAE-c11是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。2023/3/2011

三、实验流程

周三晚上6：00开始周四下午1：00开始1、制备蔗糖酶粗品E12、制作DNS比色定糖的工作曲线（当天画出工作曲线）①自溶3、制作Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线（当天画出工作曲线）②抽提

（过夜）2023/3/20124、乙醇分级和透析（制E2）

①离心得E1（无细胞抽提液）

取样、测定酶E1活力及蛋白质浓度②第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度）

③第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）④透析（过夜）

2023/3/20135、柱层析的准备工作①组装层析装置②装柱、柱平衡（过夜）

2023/3/20146、柱层析（制E3）周五下1：00开始①离心（得E2

）

取样、

测酶E2活力及蛋白质浓度

②上样

③洗柱（用目测酶活力的方法检测目的酶是否挂上）

④洗脱⑤合并酶活力峰,得E3

⑥保存成品E3

测酶E3活力及蛋白质浓度

2023/3/2015成品E3

计算出E3浓度

周六（全天）上午8：00开始

(1).蔗糖酶米氏常数的测定

(2).用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响

2023/3/2016四、操作步骤及注意事项

1、DNS比色定糖法工作曲线的制作①取11支血糖管编号1—11，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（0.2%）、蒸馏水、3，5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：①一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅；②用秒表记时），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的A值。②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。2023/3/20173，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作试号含糖量葡萄糖标准液去离子水3，5-二硝基水杨酸试剂A540

（mg）（ml）（ml）（ml）

1002.03

20.40.21.8330.80.41.6341.20.61.4351.60.81.2362.01.01.0372.41.20.8382.81.40.6393.21.60.43103.61.80.23114.02.003

2023/3/20182、Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作

①取7支试管（干燥）按下表中顺序加入各种试剂并进行反应和测定

②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐标，A650值为纵坐标，画出工作曲线。

2023/3/2019**

Folin-酚法测定蛋白质含量的方法1.样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀释成一定浓度的）1ml

，其他操作（反应和比色测定）同工作曲线的制作（前页）2.蛋白质浓度的计算：

A650值对应的µg数(Pr)×10-3

Pr(mg/ml)=×稀释倍数

Pr溶液的ml数2023/3/2020**制作工作曲线的注意事项1.分光光度计的使用：

1）测样时,光吸收值A应在0.100—0.700之间，并小于标准曲线的最大值，否则，缩小or加大样品的稀释倍数，重测！

2）其他，见（523室）操作规程；2.比色杯的使用：

1).洗净（洗净的标准是：透明、无痕迹、不挂水珠）后，置小烧杯内用蒸馏水浸没；

2).用蒸馏水orbuffer校正（方法在仪器室讲），然后在杯底标上记号（0、1、2、3）；

3).向杯中加样液时，按浓度从低到高的顺序加，注意加样到比色杯的2/3处；

4).如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头纸向一个方向檫至透明；

5).将装有参比、样品溶液的比色杯放入比色杯架上时，要摆放在一条直线上；2023/3/20216).倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸上吸干；

7).任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上；

8).自备废液杯（盛废液及废纸块用）；

9).各台分光光度计的比色杯是配套的，不许随意调换使用。3.工作曲线的制作（以Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线为例）

1）反应：①取液量准确：移液管洗净、标号、润洗，最好同一人取样；②温度准确：（恒温水浴中放有温度计），记时准确（用秒表）；③所用的标准液、buffer、反应液应是同一批配制的；

④加入Folin-乙试剂时要特别小心！因为Folin-乙试剂只有在酸性条件下稳定，而反应是在碱性溶液中进行，所以加入Folin-

乙试剂后，一定要迅速摇匀（加一管摇一管）；2023/3/20222）测量：①由同一个人读数；②制作标准曲线及测量样品使用同一台仪器；3）记录：①实验记录本记录要清晰（不许用纸片），实验结束后要请教师签字；②记录仪器使用情况。4）制图：①标明：曲线名称、纵横坐标的单位、仪器号、使用时间；②注意实验点的分布、大小（依据误差）、直线的角度（最好在45度左右）；③不许延长工作曲线（比耳定律适用于稀溶液中的反应）。附：标准液的配制：①浓度必须准确，要注意烘干、称量、定容等操作；②分装or取液时防止被稀释！2023/3/20233、蔗糖酶粗品（E1）的制备①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，8000r/min

离心10min，弃沉淀及脂层，得E1（无细胞提取液）；量体积V1=（）ml（取出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度）。

4、乙醇分级和透析（制E2）①测E1pH、用稀HAC调pH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过）；②第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度）：计算出使E1的乙醇浓度达32%时，所需95%乙醇的体积X1，将E1和乙醇X1，放入冰盐浴中预冷，在不断搅拌下，缓慢滴加乙醇，3000r/min，离心5min，弃沉淀，留上清；

2023/3/2024③第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）：同上法加入X2（为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的95%乙醇的体积），离心3min，弃上清，沉淀立刻用10ml0.005mol/LpH6.0的磷酸buffer溶解，并装入透析带（截止分子量一万的），对上述buffer透析过夜；次日，3000r/min离心3min，得E2，量体积V2=（）ml（留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其他酶液准备上样。5.柱层析（制E3）①装柱：本实验使用的层析柱是自加工的，用泡沫海绵为筛板。装入纤维素前，先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定；将纤维素用起始缓冲液调稀、搅允后加入，柱内的纤维素应非常均匀地分布，防止出现节面和气泡，床面要平整，床高距柱顶2－3cm为宜；用起始缓冲液洗柱,控制好流速（防止流干），于4℃平衡过夜。2023/3/2025

②上样：次日，将柱中的缓冲液逐渐放出，当顶部液面达到近于柱床表面时，开始用细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样E2，待样液达2cm后再在柱中间小心加样，注意控制流速，使流出液的流出速度为1ml/min左右。

③洗柱：样品全部进入床面后，用5倍柱体积的起始缓冲液流过层析柱，洗出未吸附的物质，此时应目测酶活力，检查流出液中是否有酶活力存在（即目的酶是否挂在纤维素上）。

④洗脱：因梯度洗脱装置不齐，本实验用阶段洗脱进行。用含0.15mol/LNaCl的0.005mol/LpH6.0的磷酸缓冲液100ml，控制流速为1ml/min,用小试管收集，3ml/每管。

⑤收集酶活力峰：每隔一管目测酶活力，确定酶活力峰的位置，合并酶活力峰,得进一步提纯的E3，量出E3的体积V3=（）ml（留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其它酶液封好、记名，于4℃保存，留反应动力学性质实验使用。

2023/3/2026

6、蔗糖酶活力及蛋白质含量的测定

（一）、蔗糖酶活力的测定：

1.蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。

2．操作：取两支试管分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管；把两支试管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中预热恒温；分别取2ml5%的蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间，3分钟后于测定管中加入0.5ml1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应

3.从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。

4.在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：蔗糖酶活力单位=葡萄糖毫克数×9×酶的稀释倍数2023/3/2027

（二）、目测酶活力的方法：1.洗柱时用的目测酶活力方法：取两支试管，各加入1ml5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始缓冲液，另一支中加1ml洗柱流出液，同时于35℃恒温水浴中进行水解反应3min，然后各加DNS试剂1ml，于沸水浴中反应5min，比较两支试管颜色的深浅；2.收集酶活力峰时用的目测酶活力方法：于收集管（每隔一管）中取0.1mlE液+1ml5%蔗糖液，于35℃水解反应3min后，加0.2ml1mol/LNaOH终止反应，然后加DNS试剂1ml，于沸水浴中准确反应5min，比较各管颜色的深浅，再加密实验点，重复测定，确定酶活力峰的位置。（三）、三种蔗糖酶（E1、、E2、E3）蛋白质浓度的测定：用Folin-酚法测定。

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五、结果及数据处理

1.洗脱曲线

蛋白酶质活含力量管号2.原始数据

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3.数据处理

有关计算

1）[E]=葡萄糖mg数×（4.5/0.5）×E的的稀释倍数/2ml=（）u/ml2）总活力：[E]×V3）[Pr]：查标准曲线

4）总Pr量：[Pr]×V5）比活力：[E]/[Pr]or总活力/总Pr量

6）阶段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力

7）总收率：E3总活力/E1总活力

8）提纯倍数：比活力n/比活力n-1n=1，2，3

将计算出的数据添入下表中：2023/3/20304.实验结果表蔗糖酶酶样品E１E２E３酶浓度总活力蛋白浓度总蛋白量比活力提纯倍数阶段收率总收率（ml）（u/ml）（u）（mg/ml）（mg）（u/mg）（%）（%）样品体积2023/3/2031

六、主要参考资料

1、李建武主编.生物化学实验原理和方法.

北京大学出版社.1994该书中的：p36-46

（离子交换层析法）

2、沈同王镜岩主编.生物化学第二版上册高等教育出版社.1993该书中的：p209、

210、215、216、220中有关论述

3、张树政主编.酶制剂工业上册.科学出版社.19982023/3/2032

七、思考题

1）指出有机溶剂分级沉淀法的原理及操作中的注意事项。2）

说明离子交换柱层析的原理及装好层析柱的具体要求。3）

比较线性梯度洗脱与阶段洗脱的区别。4）分别指出判断酶损失程度和酶提纯方法优劣的标志。2023/3/2033其它1）这个实验较大，涉及到的理论知识和实验技术都较多，用的时间也很长，要求同学们一定做好预习，写好预习报告（方式不限，但一定要写在本子上，并留出记录实验数据和实验现象的位置），否则将严重影响实验进度！2）你们年级的理论课还没讲到酶学部分，预习时可以看实验课教材（我在编写时已经进行了整理和补充）,但教材中有印刷错误,应以该课件为准.3）本实验从一开始，就要纵观全局，在各个环节都要注意防止酶失活；只要时间允许，一定要用测定酶活力的方法跟踪酶的去向；4）实验制品E3要保留！酶促反应动力学性质实验用。2023/3/2034蔗糖酶米氏常数的测定

一、目的要求：了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习蔗糖酶米氏常数的测定方法。二、实验原理：米氏常数Km等于酶反应速度达最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。对于某一种特定的酶，在特定的反应条件下，对应任何一种底物（如果它具有多个底物），它的米氏常数

Km是一个定值。在一个反应中，底物的浓度（S）是可以控制的，反应的速度（V）可以测出，这样就可根据底物的浓度和反应的速度求出该酶在本实验条件下的米氏常数。通常可以通过以下几种方法求出Km值：

1）直接将数据代入米氏方程。

2）Lineweaver-Burk双倒数作图法（本实验采用该法），横轴的截距为：-1/Km。

3）Hanes-Woolf作图法，横轴的截距为：-Km。

4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作图法，斜率为：-Km。

5）Eadie-Scatchard作图法，斜率为-1/Km。2023/3/2035三、操作方法：1.取试管8支，按0、1--7编号，0为空白。2.按表1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃

水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。3.取约20ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。4.于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35℃水浴中准确反应3min。5.按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/LNaOH，摇匀，终止反应。6.吸取反应混合物0.5ml，加入盛有1.5mlDNS试剂和1.5ml

去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值。2023/3/2036表1Km值的测定

2023/3/2037四数据处理：以A值作为相对反应速度，以1/S为横坐标，1/A为纵坐标作图，由图求出Km值。五、思考题：

1.

说明米氏常数的物理意义及单位？

2.

用双倒数法测定Km值时，应注意的主要问题是什么？

2023/3/2038用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响一、目的要求

1.初步掌握正交实验设计方法的使用；

2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。二、实验原理

1.酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。本实验使用正交实验设计法测定温度、pH值、和离子浓度三种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（≥3）的实验方法。2023/3/2039

正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信息”的实验设计原则。

2.本实验以自制的蔗糖酶（E3）为测定对象。蔗糖酶是一种水解酶，可使蔗糖水解为D-果糖和D-葡萄糖。

酶活性的测定，是利用DNS试剂与D-葡萄糖共热后生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，葡萄糖的量和反应液的颜色呈比例关系，利用比色法可测得酶促反应后生成的还原糖量。2023/3/2040三、操作方法

1.实验设计：

1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活力。这里，用A540值表示，能落在葡萄糖工作曲线范围内的A540值越高，指标越好。

2）制定因素水平表：考察三个因素（温度、pH值和离子浓度），每个因素取三个水平。水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如表1。

2023/3/2041

表1因素水平表

2023/3/20423）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的三个因素，故选用L9（34）表，见表2。按一般的实验方法：①简单比较法（最常用），因实验点分配不均衡，易把好条件漏掉，又因数据无规律而对结果无法进行分析和判断。②全面实验法：（即对三个因素三个水平的各种搭配都考察）要进行33=27次实验。而用正交表L9（34），只做九次实验，就可以找到好的实验条件。2023/3/2043而且，还可以进行如下分析：A.判断各因素的水平范围是否选偏；B.判断各因素显著性大小的顺序；C.判断实验结果的置信度。由表2可见，正交表L9（34）有任何正交表都具有的如下特点：

A.任何一列各水平出现的次数相等，该表均为3次。2023/3/2044

表2正交表L9（34）

2023/3/2045B.任何两列横行组成的数字对出现的次数都相等。该表有9个数字对，即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3）都出现一次。

C.任何两列同名数对出现的次数都相等。该表中有3个同名数对，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出现一次。以上特点，保证了用正交表安排的实验计划是均衡搭配的，因此可以进行综合比较和方差分析。

4）安排实验：将本实验的三个因素分别放在L9（34）表的第1、2、3列中，再将各列的水平数用该因素相应的水平写出来，即得到实验安排表，见表4的上半部分。2023/3/20462.具体操作步骤：

1）将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于

9支试管中按表3进一步稀释至一定浓度。表3三种不同pHbuffer的稀释表2023/3/20472）另取18支试管，编号1—9及1`--9`（平行组），按表4中2、3列的要求，分别加入上述不同pH不同浓度的缓冲液2ml及蔗糖酶液（浓度15U/ml左右）1ml，混匀。

3）按表4中第一列的要求，将1—9及1`--9`试管分别放入相应温度的恒温水浴中保温10min。

4）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分别置于20℃、35℃、50℃水浴中保温5min。

5）向1—9及1`--9`试管中，依次间隔1min（或2min