沙门氏菌的检验

沙门氏菌的检验第1页/共52页主要内容修订背景国内外方法修订内容

前增菌选择性增菌分离平板生化鉴定血清学鉴定报告第2页/共52页修订背景

第3页/共52页历史回顾

回顾一下食品卫生微生物学检验标准的制定，经历了从无到有，从事该领域的工作者，花费了巨大的心血，先后制修订了84版、94版、和2003版的检验标准，每版的标准，都为该年代的食品卫生工作提供了巨大的技术支持，同时也深深地烙上了该时代的经济特征。第4页/共52页必要性

由于食品生产及流通的全球化、新的食品加工技术的应用、东西方饮食习惯的交融、自然环境的改变等因素的影响，目前沙门氏菌污染的食物种类、季节及场所发生了重大变化。同时，随着检测技术的发展，对于沙门菌的快速检测方法层出不穷，有些方法已通过国际权威机构认证（如AOAC）成为了国际标准方法。第5页/共52页任务来源1.修订任务由卫生部全国食品卫生标准委员会下达，由微生物标准协作组具体实施。2.兄弟单位、企业、公司为参与单位。3.共采集到数据800多个，专家反馈意见50余条（采纳90%以上）条，形成标准的草案稿、送审稿。4.时间跨度2004年—2006年第6页/共52页修定原则结合目前的国际标准和原标准的实际使用情况，针对原标准的修订，我们遵循以下的修订原则：1．以原国标为基础，保持与原标准的连续性；2．参照国际分析协会（AOAC）、国际标准组织（ISO）及美国食品药品管理局（FDA）的有关标准；3．结合标准的比对实验和验证实验，积极吸取新方法、新技术，修订标准。第7页/共52页修定依据1.

GB/T4789.42.

AOACOfficialMethod：967.26，967.27，967.283.

ISO：65794.

USFDA：BacteriologicalAnalyticalManual,Chapter5:Salmonella。第8页/共52页修改内容1前增菌；2选择性增菌；3分离；4生化鉴定；5.血清学鉴定；6.报告。第9页/共52页国内外方法比较第10页/共52页国内外沙门氏菌检测方法（传统方法）国家标准USFDAFSISAOAC

ISO第11页/共52页冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃

±

1℃一般4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL＋MM（或TTB）100mL检样匀液25mL

＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学试验甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－赖＋H2S－靛－尿－KCN－赖＋/－非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验ONPG－沙门氏菌非沙门氏菌42℃18h～24h36℃

±

1℃18h～24h42℃18h～24h36℃

±

1℃18h～24h36℃

±

1℃40h～48h36℃

±

1℃18h～24h

微生物学检验沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-2003第12页/共52页

样品（20类）25g225mL乳糖肉汤（LB）or胰酪胨大豆肉汤（TSB）or煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or再造脱脂奶粉or四硫酸盐煌绿（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT43±0.2℃or35±2.0℃24±2h24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙门菌沙门菌非沙门菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A尿素酶，H抗原（多价H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐（API20E,EnterotubeII,

EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）+O抗原&H抗原细菌学分析手册（FDA/BAM）第五章沙门菌属第13页/共52页肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定USDA/FSISMLG4.02样品BPWorBPW（含结晶紫）35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL＋10mLTT0.1±0.02mL＋10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清学试验商业生化试剂盒或自动鉴定系统or传统生化鉴定报告结果第14页/共52页AOAC沙门菌检测方法AOACOfficialMethod967.25SalmonellainFoodsPreparationofCultureMediaandReagentsAOACOfficialMethod967.26SalmonellainProcessedFoodsDetectionAOACOfficialMethod967.27SalmonellainFoodsIdentificationAOACOfficialMethod967.28SalmonellainFoodsSerologicalTests第15页/共52页食品中的沙门菌检测方法AOAC967.25－967.28处理样品沙门菌1mL+10mLSC1mL+10mLTT35℃24±2hXLD&HE&BS35℃24±2h（BS24h&48h）35℃24±2hTSI&LIA35℃24±2h纯培养物不纯培养物纯培养物MACorXLDorHE尿素酶－尿素酶＋非沙门菌H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原非沙门菌补充生化试验酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐非沙门菌第16页/共52页25g样品225mLBPW35℃or37℃16~20h0.1mL+10mLRV10mL+100mLSC42℃24h35℃or37℃24h,48h酚红煌绿琼脂（亮绿琼脂）&第二种选择性平板35℃or37℃

20~24h无典型菌落再培养18～24h典型菌落（pinkred）营养琼脂纯化可疑菌落35℃or37℃

18~24hTSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚血清学试验（O抗原，Vi抗原，H抗原）报告结果送参考实验室分型ISO6579:1993(E)

微生物－沙门菌检测的通用方法第17页/共52页修订内容第18页/共52页沙门氏菌检验1前增菌2选择性增菌3分离4鉴定5报告第19页/共52页检样36℃±1℃，8h～18hTSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素(pH7.2)，KCN挑取可疑菌落BSXLD（或HE、科玛嘉显色培养基）1mL+TTB10mL1mL+SC10mL25g（mL）样品+225mLBPWH2S+靛基质-尿素-KCN-

赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-反应结果与左侧描述不符商品化生化鉴定系统42℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，40h～48h36℃±1℃，18h～24h甘露醇+、山梨醇+ONPG-报告非沙门氏菌沙门氏菌，血清学试验沙门氏菌检验程序第20页/共52页前增菌1取消样品分类，前增菌液统一为“缓冲蛋白胨水”原国标：BPWFDA、AOAC：多种前增菌液ISO：BPW第21页/共52页

前增菌（续）2对所有样品均进行8-18h前增菌原国标只对冻肉、乳品、蛋品等加工食品进行前增菌，FDA、AOAC、ISO、CanadaMFHPB、CCFRA等组织或国家对所有样品都进行前增菌。第22页/共52页前增菌（续）3修改了样品处理方式

增加拍击式均质器，均质袋可直接培养。4增加调整pH值

第23页/共52页选择性增菌1使用“TTB、SC”，取消“MM”

原国标：“MM或TTB、SC

AOAC：TT、SC

FDA：RV、TT

ISO：RV、SC

选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。第24页/共52页分离培养基使用BS、XLD、HE、科玛嘉显色培养基

原国标：BS、DHL（或HE、WS、SS）FDA：BS、XLD、HEAOAC：BS、XLD、HEISO：phenolredbrilliantgreen琼脂、BS或HE

为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。

第25页/共52页分离培养基回收率测定（%）I-SS65.3I-SS-M81.0C-SS52.0I-HE83.2C-HE80.0I-XLD83.0C-XLD86.2I-BS106.6C-BS77.7CHRO68.4C-DHL98.4C-WS71.6TSA（对照）100.0I：进口C：国产第26页/共52页典型菌落--BSC-BSI-BS第27页/共52页典型菌落--HEC-HEI-HE第28页/共52页典型菌落--XLDI-XLDC-XLD（变形菌落-错误）第29页/共52页典型菌落--CHRO第30页/共52页样品+BPW+SC+CHRO第31页/共52页样品

+BPW

+TTB

+CHRO第32页/共52页样品

+BPW

+MM

+CHRO第33页/共52页生化鉴定1）

采纳API20E或VitekGNI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。

第34页/共52页生化鉴定(续)2）

生化鉴定项目进行调整原国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基；现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了API20E或VitekGNI鉴定的需要。第35页/共52页生化鉴定（续）2）

生化鉴定项目进行调整（续）为保持与原标准的一致性，本标准也保留了可以同时直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、KCN培养基的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留样确认的部分，以备必要时复查，这对生化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非常必要的。第36页/共52页API20E第1位数第2位数第3位数第4位数第5位数第6位数第7位数结果判定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX124124124124124124124反应结果-+++++-----+++++-+-+-沙门菌应得树枝024124000004124104020组合编码

6

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0

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2第37页/共52页API20E沙门氏菌20E鉴定结果第38页/共52页API20E布氏柠檬酸杆菌20E鉴定结果第39页/共52页API20E河生肠杆菌20E鉴定结果

第40页/共52页VITEKGEN+应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。第41页/共52页

VITEK

第42页/共52页血清学鉴定1血清学鉴定中的菌体分群为选择性试验项目

原国标进行O抗原、H抗原鉴定及菌体分群；FDA、AOAC进行O抗原、H抗原鉴定，菌体分群