丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书目得承受PCR,用于临床血清或血浆标本中得丙型肝炎病毒核酸得定性检测,适用于丙型肝炎病毒感染得关心诊断。范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。3、职责3、1操作人员:负责标本制备检测、仪器操作、报揭露送。3、2专业组组长:负责本组耗材得请购,监视本组标本检测、仪器操作、报揭露送、质控治理等各方面工作。3、3试验室主任:负责监视与指导试验室各方面工作。4、原理承受荧光PCR技术,以丙型肝炎病毒基因编码区得高度保守区为靶区域,设计特异性引物及荧光探针,进展一步法RT-PCR扩增,并检测荧光信号,仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线,依据阈循环值(CT)实现对未知样本得检测。另外,本试剂盒带有内标物质,用于对核酸提取得整个过程进展监控,削减假阴性结果得消灭。5、样本要求5、1适用标本类型:血清5、2标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入无菌得真空采血管中(),室温(22-25℃)30-60min血标本可自发完全凝集析出血清,或直接使用水平离心机,1500rpm离心5min;吸取上层血清,1、5ml灭菌离心管。5、3标本保存与运送所采集得标本可马上用于测试或长期保存于-70℃,也可保存于-20℃待测,保存期为3个月,标本应避开反复冻融。标本运送承受干冰(或者冰袋)保持低温,4天。5、4拒收标本:拒绝重度溶血样本、肝素抗凝得血浆。6、仪器与试剂6、1设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。6、2试剂生产厂家:中山大学达安基因股份产品标准批号:YZB/国7271-2023最低检出量:500IU/ml1:表1 试剂盒组分表组分名称规格数量RNA提取液A200ul/管1核酸提取试剂RNA提取液B5ml/瓶2DEPCH2O3ml/瓶1HCV内标溶液100ul/管1PCR检测试剂HCV反响液A270ul/管1HCV反响液B30ul/管1阴性质控品200ul/管1质控品HCV强阳性质控品200ul/管1HCV临界阳性质控品200ul/管177、1试剂预备(试剂储存与预备区)7、1、1进入试剂预备区,翻开通风设备,依据消毒清洁程序擦拭试验台面,并在检验流程记录表上做相应记录。7、1、2PCR反响液配制7、1、2、1取出HCV反响液A、HCV反响液AB,室温溶化后振荡混匀,8000rpm离心数秒后使用。7、1、2、2取出N个(N=待测样本数+4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔)PCR反响管,HCV2:组分HCV反响液AHCV组分HCV反响液AHCV反响液B总体积用量/人份27ul3ul30ul将各组分充分混匀,混合好后进展短时离心将管壁上得液体全部离心至管底,30ul扩增体系分装到PCR反响管,反响液分装时尽量避开产生气泡,盖紧管盖,经传递窗传递到标本制备区。7、1、375%乙醇配制:2、25mlDEPCH2O,6、75ml得无水乙醇,振荡混匀,75%乙醇,盖紧盖子,经传递窗传递到标本制备区。7、2RNA提取(标本制备区)7、2、1进入标本制备区,从传递窗中取出PCR75%乙醇,放入标本制备区冰箱冷藏。7、2、2RNA提取液A、RNA提取液B,备用。7、2、3翻开金属浴,65℃,使仪器自动升温。7、2、4用镊子夹取n1、5ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。(n=待测样本数+3=待测样本数+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品)7、2、510ul内标溶液,200ul样本,800ulRNA提取液B,盖紧管盖,振15s以充分混匀,5min(1min5s,使裂解更充分,)7、2、6200ul无水乙醇,盖紧管盖,15s以充分混匀,瞬时离心,20ulRNA提取液A5s,1min。8000rpm1min,留神吸弃上清。727200ulRNA提取液B,盖紧管盖,充分混匀(用移液枪吹打),8000rpm1min,留神吸弃上清。7、2、875%400ul充分混匀,8000rpm1min,留神吸弃上清。7、2、975%400ul充分混匀,8000rpm1min,留神吸弃上清。7、2、10翻开管盖,放入金属浴,655min,使液体挥发完全。7、2、115min后,用镊子从金属浴中取出离心管,50ulDEPCH2O,用移液枪吹打混匀,室温1min后,8000rpm1min。离心管内得上清液即为病毒核酸溶液,建议马上使用,如需保存,置于-70℃。7、2、13取出已分装好得PCR反响管,向对应编号得PCR管中参与处理好得得样品(包括待测标本、)20ul,空白比照不加模板,8000rpm离心数秒,经传递窗移至扩增检测区。(用移液枪留神吸取上清液,尽量不要遇到底层沉淀。)7、3PCR扩增(扩增区)7、3、1从传递窗中取出PCR反响管,放入仪器样品槽内。7、3、2在“Setup”按对应挨次设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测标本,并在“samplename”一栏中设置样本名称,探针检测模式设置:ReporterDye1:FAM,QuencherDye1:none;ReporterDye2:VIC,QuencherDye2:none;PassiveReference:NONE。具体设置方法参考《AB7500核酸扩增仪标准作业指导书7、3、3 翻开“RunMethod”窗口设置循环条件:50℃15min,1个循环;95℃5min,1个循环;94℃15s → 55℃ 45s(收集荧光),45个循环;7、3、4保存文件,运行仪器。8、结果分析8、1反响完毕后,操作人员可依据实际状况自行调整BaselineStart值、End值以及Threshold值。Start3-15,End5-20Log图谱窗口设置得ThresholdValue值,使阈值线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品得扩增曲线平直或低于阈值线。点击Analysis自动获得分析结果,Report界面查瞧结果,记录样本数值(C)。8、2假设反响体系扩增曲线在FAM检测通道无明显对数增长期,VIC检测通道有对数增长期,则判定样品得HCVRNA阴性。83假设反响体系扩增曲线在FAMVIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道CT≤45;或者扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且CT≤45,VIC检测通道无对数增长期,则判定样品得HCVRNA阳性性。9、质量把握每次试验均需检测阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品。质控品结果满足质量把握要求时方可进展检测结果得推断。9、1试剂盒自带质控阴性质控品:FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期,VIC检测通道扩增曲线有明显对数增长期。HCV阳性质控品:FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期,FAM检测通道CT≤30,临界阳性质控品FAM检测通道≤36。阳性定量参考品:增长曲线呈S型曲线,0、97≤r≤1。9、2室内质控每次试验应选择适当得HCVRNA质控品做室内质控。9、3以上要求(9、19、2)需在同一次试验中同时满足,否则,本次试验无效,需从进展。10、干扰因素101环境中存在RNase,可降解RNA,导致试验结果假阴性,因此试验过程应戴手套,帽子,防止皮屑、毛发等得RNase,试验用品需高压灭菌后使用,尽量避开污染。10、2临床标本中内源性抑制物:血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类、等都可抑制PCR反响,标本应避开溶血、脂血、黄疸等。10、3外源性抑制物:肝素抗凝剂、纤维素与硝酸纤维素、手套上得滑石粉、标本容器上得抑制物等,标本应按采集要求采集,操作中应留神慎重,标本容器及试验用具应鉴定合格。104标本得穿插污染:操作过程中应细心认真,防止穿插污染,尽量使用带鉴定合格得滤芯吸头,阴性比照品应与标本一起提取,以准时觉察穿插污染。11、生物参考区间1、0×102IU/ml~1、0×108IU/ml12、警示/危急值:HCVRNA检测无警示/危急值。13、特别结果处理如遇HCVRNA检测结果与临床诊断或资料,或与近期历史检测结果不相符合,应准时与临床医生联系、沟通,查找缘由并实行措施,于《疑问报揭露放处理记录表》中记录处理过程。如需复查,需准时保存标本。14、临床意义HCV15、变异得潜在来源标本保存不当或反复冻融,都会影响检测结果得准确。16、留意事项16、1,接触标本后必需准时更换手套。16、2阳性质控品与检测样本均应视为具有传染性物质,应避开接触到皮肤与粘膜。16、3试验过程必需严格分区操作,各区物品均为专用,不得穿插使用。16、4样品得处理操作应在生物安全柜内进展。16、5所用检测试剂使用前应完全解冻,瞬时离心后使用,应避开反复冻融。16、6样本核酸提取后,建议马上进展下一步试验,否则请保存于-20℃待用(24h)。16、7操作过程中应防止穿插污染,尽量使用鉴定合格得滤芯吸头,阴性比照品应与标本一起提取。16、8加样时应使样品完全落入反响液中,不应有样品粘附于管壁上,尽快盖紧管盖。上机前留意检查各反响管就是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。16、9标本制备区所用到得试管、吸头等需打入盛有消毒剂得容器,并与废物一起灭菌前方可丢弃。16、10扩增完毕马上取出反响管,密封在专用塑料袋