分子生物学许晓东

2.1染色体当前第1页\共有149页\编于星期五\3点2.1.1染色体概述染色体(chromosome)是细胞核中载有遗传信息的物质，在显微镜下呈丝状或棒状，由核酸和蛋白质组成，在细胞发生有丝分裂时期容易被碱性染料着色，因此而得名。同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不同染色体或不同种中间变化很大。原核细胞染色体外裹着稀疏的蛋白质，其中一部分与DNA的折叠有关，另一些则参与DNA复制、重组及转录过程。真核细胞的染色体中，DNA与蛋白质完全融合在一起，其蛋白质与相应DNA的质量比约为2:1。此外还有少量RNA。当前第2页\共有149页\编于星期五\3点当前第3页\共有149页\编于星期五\3点人类染色体显微结构图19Mb210genes240Mb3453genes当前第4页\共有149页\编于星期五\3点当前第5页\共有149页\编于星期五\3点DNA的分布主要在染色体上细胞质内细胞核遗传细胞质遗传生物的遗传例：紫茉莉叶色的遗传当前第6页\共有149页\编于星期五\3点在分子生物学中，我们用“染色体DNA”，是为了区别质粒、线粒体和叶绿体DNA。了解染色体，是为了了解DNA的存在状态，同时也是为了理解染色体水平的基因表达调控。染色体本身也是分子生物学家的研究材料，比如针对端粒的研究。当前第7页\共有149页\编于星期五\3点2.1.2真核细胞染色体的组成染色体作为遗传物质的特征：分子相对稳定；能自我复制，保持遗传连续性；能指导蛋白质合成，控制生命过程；能产生可遗传的变异。当前第8页\共有149页\编于星期五\3点当前第9页\共有149页\编于星期五\3点化学组成(1).DNA：约占30%，每条染色体一个双链DNA分子是遗传信息的载体，也就是所谓的遗传物质(2).蛋白质组蛋白(histone)：呈碱性，结构稳定；与DNA结合形成、维持染色质结构，与DNA含量呈一定的比例非组蛋白：种类和含量不稳定；作用还不完全清楚，可能与染色质结构调节有关，在DNA遗传信息的表达中有重要作用(3).少量的RNA（含量小于DNA含量的10%）当前第10页\共有149页\编于星期五\3点1.蛋白质包括组蛋白（Histone）和非组蛋白。富含赖氨酸和精氨酸HistonewereanalyzedbySDS当前第11页\共有149页\编于星期五\3点当前第12页\共有149页\编于星期五\3点组蛋白的特性1.进化上的极端保守性特别是H3、H4，牛、猪、大鼠的H4完全相同，牛和豌豆的H4只有两个氨基酸的差异。2.无组织特异性仅发现两个例外（鸟鱼两栖红细胞H1->H5，精细胞鱼精蛋白）3.肽链上氨基酸分布的不对称性N端碱性氨基酸C端疏水氨基酸4.组蛋白的修饰作用甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP核糖基化等

5.富含赖氨酸的组蛋白H5只存在于鸟类、两栖类等含有细胞核的红细胞中当前第13页\共有149页\编于星期五\3点当前第14页\共有149页\编于星期五\3点当前第15页\共有149页\编于星期五\3点肽链上氨基酸分布的不对称性N端碱性氨基酸C端疏水氨基酸当前第16页\共有149页\编于星期五\3点组蛋白的修饰作用——影响组蛋白与DNA的亲和性，调控基因表达。Sitesofpost-translationalmodificationsonthehistonetails.Themodificationsshownincludeacetylation(purple),methylation(red),phosphorylation(green),andubiquitination(orange).——Genes&Dev.

2001.

15:2343-2360

当前第17页\共有149页\编于星期五\3点非组蛋白（含量约为组蛋白的60-70%）包括酶类和细胞分裂有关的蛋白（收缩蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白）高速泳动蛋白（highmobilitygroupprotein,HMG蛋白）能与DNA结合，也能与H1作用，可能与超螺旋结构有关。DNA结合蛋白可能是一些与DNA复制或转录有关的酶或调解物质。A24非组蛋白C端与H2A相同，功能不详当前第18页\共有149页\编于星期五\3点2.真核生物基因组DNA特点：含有大量的重复序列；功能DNA序列大多被非功能DNA隔开。C值(Cvalue)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象(C-valueparadox)：C值往往与种系进化的复杂程度不一致。当前第19页\共有149页\编于星期五\3点当前第20页\共有149页\编于星期五\3点不重复序列一个或几个拷贝，占DNA总量的40-80%，序列长约750-2000bp.单拷贝基因也可以合成大量蛋白：蚕丝心蛋白DNA—104mRNA—109protein中度重复序列重复次数10-104，占DNA总量的10-40%，编码rRNA、tRNA和某些结构蛋白。

高度重复序列卫星DNA(satelliteDNA)，占基因组的10-60%，由6-100个碱基组成，大多位于染色体着丝粒，功能不明，可能与染色体的稳定性有关。当前第21页\共有149页\编于星期五\3点卫星DNA(satelliteDNA)当前第22页\共有149页\编于星期五\3点3.染色质和核小体(Chromatinandnucleosomes)染色质DNA的Tm值比自由DNA高。染色质DNA的复制和转录活性比自由DNA低。DNA酶I(DNaseI)对染色质DNA的消化慢于纯DNA。延伸Tm值:DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度当前第23页\共有149页\编于星期五\3点核小体(nucleosome)是一种串珠状结构，由核心颗粒和连结线DNA两部分组成，可描述如下：①每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1；②由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成核心颗粒；③DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合；④相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。当前第24页\共有149页\编于星期五\3点ShorterlinkerDNAfavorLongerlinkerDNAfavor当前第25页\共有149页\编于星期五\3点用小球菌核酸酶(Micrococcusnuclease)消化染色质DNAJBCApril27,2007vol.282no.1712537-12546当前第26页\共有149页\编于星期五\3点核小体单体被微球菌核酸酶处理后，随着时间延长，其降解产物(DNA片段)会逐渐缩短，从200bp降至146bp，至此很难再进一步降解。这种稳定结构为核心颗粒，它是由146bp的DNA片段和H2A、H2B、H3和H4各2分子组成。当前第27页\共有149页\编于星期五\3点从DNA到染色体当前第28页\共有149页\编于星期五\3点染色体结构的矛盾及协调DNA与组蛋白及其它包装蛋白的结合降低了其可接近的能力。这种可接近能力的降低会影响介导DNA复制、修复、转录和重组的蛋白与DNA间的接近和相互作用。解决压缩DNA和接近DNA的矛盾就是如何调控染色质的结构.研究已表明，单个核小体的结构变化可允许染色体该区域的DNA与其它蛋白相互作用。核小体的结构变化可由修饰和重建核小体的酶所介导。因此，了解核小体的结构及其变化调控是解释真核细胞DNA复制、重组、转录等过程的关键。当前第29页\共有149页\编于星期五\3点Certainstainingtechniquescausethechromosomestohavetheappearanceofaseriesofstriations,whicharecalledG-bands.ThebandsarelowerinG-Ccontentthantheinterbands.GenesareconcentratedintheG-C-richinterbands.ThehumanXchromosomecanbedividedintodistinctregionsbyitsbandingpattern扩展：ChromosomesHaveBandingPatterns当前第30页\共有149页\编于星期五\3点果蝇(Drosophila)染色体结构图通过染色体形态，可以研究基因缺失、重复和倒置。当前第31页\共有149页\编于星期五\3点PhotocourtesyofJoséBonner,IndianaUniversityThepolytenechromosomesofD.melanogasterformanalternatingseriesofbandsandinterbandsIndividualbandscontainingparticulargenescanbeidentifiedbyinsituhybridizationPolyteneChromosomesFormBands当前第32页\共有149页\编于星期五\3点真核生物基因组的结构特点基因组庞大存在大量重复序列大部分为非编码序列（>90%）转录产物为单顺反子(见下页解释)真核基因是断裂基因，有内含子存在大量顺式作用元件（启动子、增强子、沉默子）存在大量的DNA多态性有端粒结构相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。当前第33页\共有149页\编于星期五\3点延伸：什么是顺反子(cistron)当前第34页\共有149页\编于星期五\3点2.1.3原核生物基因组1结构简练绝大部分编码蛋白质2存在转录单元功能相关的基因往往集中在一起，它们可被一起转录成多顺反子mRNA3有重叠基因阅读框改变或不改变当前第35页\共有149页\编于星期五\3点重叠基因OverlappinggenesBMCGenomics2008,9:169当前第36页\共有149页\编于星期五\3点2.2DNA的结构当前第37页\共有149页\编于星期五\3点2.2.1DNA的一级结构DNA（脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid）的组成成分：核糖和脱氧核糖嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)当前第38页\共有149页\编于星期五\3点当前第39页\共有149页\编于星期五\3点当前第40页\共有149页\编于星期五\3点多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生当前第41页\共有149页\编于星期五\3点DNA的方向是5’-3’（蛋白质是N-C）DNA通常以线性或环状形式存在DNA通常是双链的(dsDNA)，少数是单链的(ssDNA)DNA的一级结构是指4种核苷酸的排列顺序。GC丰富区易形成左手螺旋反向重复的片段易形成发夹结构一级结构对高级结构的影响：延伸：5‘TCTCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGAGA’3

3‘AGAGAGAGAGAGATCTCTCTCTCTCT’55‘NNNGAAGGTCCNNNNGGACGTTCNNN’3

3‘NNNCTTGCAGGNNNNCCTGCAAGNNN’5反向重复序列（invertedrepeatsequence）回文结构（Palindrome）NNNNCGCGTAGCGCATATGCNNNNNN当前第42页\共有149页\编于星期五\3点2.2.2DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。当前第43页\共有149页\编于星期五\3点碱基间形成的氢键当前第44页\共有149页\编于星期五\3点B-DNA的反向平行双螺旋结构克里克的草图当前第45页\共有149页\编于星期五\3点大沟通常是蛋白质与DNA相互作用的部位……当前第46页\共有149页\编于星期五\3点Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)areartificialrestrictionenzymesgeneratedbyfusingaTALeffectorDNAbindingdomaintoaDNAcleavagedomain.当前第47页\共有149页\编于星期五\3点DNA缠绕在组蛋白上……当前第48页\共有149页\编于星期五\3点B构象：生物体内天然存在的DNA几乎都以B-DNA存在。A构象：是在以钠、钾或铯作为反向离子时，将DNA纤维在75%相对湿度下进行X光衍射测定出来的。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链结构均为A构象。Z构象：在DNA进行转录或其他一些生理过程中会产生Z-DNA结构，之后DNA会放出能量，形成B-DNA。GC含量高的区域易于形成Z构象。当前第49页\共有149页\编于星期五\3点右手螺旋：A-DNA,B-DNA左手螺旋：Z-DNA当前第50页\共有149页\编于星期五\3点Z－DNA的生物学意义：应当指出Z－DNA的形成通常在热力学上是不利的。因为Z-DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。但是，DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。

此外，DNA螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。Z-DNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。

这些都暗示Z-DNA的存在不仅仅是由于DNA中出现嘌呤-啶嘧交替排列之结果，也一定是在漫漫的进化长河中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果，有其内在而深刻的含意，只是人们还未充分认识而已。当前第51页\共有149页\编于星期五\3点当前第52页\共有149页\编于星期五\3点扩展：其他结构Hollidayjunction由重复排列的端粒构成的脱氧核糖核酸四联体结构形态当前第53页\共有149页\编于星期五\3点DNA双链的变性与复性加热、提高pH、降低离子强度，都能使DNA双链变性。反之，变性的DNA又可以复性。G+C含量、离子强度和DNA的均一性都会影响变性曲线。当前第54页\共有149页\编于星期五\3点2.2.3DNA的高级结构DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。1965年Vinograd等用电镜发现SV40和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋。负超螺旋松弛DNA正超螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶supercoiledlinear

opencircularTopoisomerase当前第55页\共有149页\编于星期五\3点L=T+WL(linkingnumber)：环形DNA分子两条链间交叉的次数T(twistingnumber)：盘绕数W(writhingnumber)：超螺旋数当前第56页\共有149页\编于星期五\3点对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，同样具有超螺旋形式。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。当前第57页\共有149页\编于星期五\3点2.3DNA的复制过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。起始-延伸-终止当前第58页\共有149页\编于星期五\3点2.3.1DNA的半保留复制最初推测的复制模型当前第59页\共有149页\编于星期五\3点2.3.2DNA复制的一些基本概念复制起点（复制原点,Theoriginofreplication）是固定的，能识别参与复制起始的特殊蛋白质。DNA从复制起点开始复制直到终点为止，每一个这样的DNA复制单位称为复制子（replicon）。当前第60页\共有149页\编于星期五\3点从复制起点开始，双链解开形成叉子状的生长点，叫复制叉（replicationfork）。复制叉移动的方向和速度是多种多样的，但以双向等速移动为主。真核生物： 双向等速原核生物： 双向等速（大肠杆菌） 双向不等速（枯草杆菌） 先单向后双向（R6K质粒） 单向（ColE1质粒） 相向（某些线性DNA病毒：腺病毒）当前第61页\共有149页\编于星期五\3点当前第62页\共有149页\编于星期五\3点2.3.3复制的几种主要方式当前第63页\共有149页\编于星期五\3点DNA的生物合成只能从5’到3’起始的时候需要一个自由的羟基当前第64页\共有149页\编于星期五\3点1线性DNA双链的复制所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5’向3’端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是5’→3’；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5’端如何起始呢？end-replicationproblem当前第65页\共有149页\编于星期五\3点通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如λ噬菌体（成环）、T7噬菌体（多聚分子）。DNA可形成特殊的结构。如草履虫的线性线粒体DNA在末端形成发夹，使分子没有游离末端。某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5`端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA。末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）。当前第66页\共有149页\编于星期五\3点??二聚体ATCGTAGCATCGTAGC专一性核酸内切酶T7噬菌体的末端复制当前第67页\共有149页\编于星期五\3点草履虫线粒体DNA的末端复制CurrGenet(1993)24:241-247当前第68页\共有149页\编于星期五\3点腺病毒通过蛋白引发的DNA复制当前第69页\共有149页\编于星期五\3点端粒的复制NatureReviewsCancer1,203-213(December2001)当前第70页\共有149页\编于星期五\3点延伸端粒

2009

NobelPrizeforPhysiologyorMedicine:ElizabethBlackburn，

CarolW.Greider

and

JackW.Szostak.SzostakJW,BlackburnEH.Cloningyeasttelomeresonlinearplasmidvectors.Cell1982;29:245-255.GreiderCW,BlackburnEH.IdentificationofaspecifictelomereterminaltransferaseactivityinTetrahymenaextracts.Cell1985;43:405-13.GreiderCW,BlackburnEH.AtelomericsequenceintheRNAofTetrahymenatelomeraserequiredfortelomererepeatsynthesis.Nature1989;337:331-7.四膜虫Tetrahymena端粒长度与衰老端粒合成模型当前第71页\共有149页\编于星期五\3点2环状DNA双链的复制θ型（如大肠杆菌E.coli）当前第72页\共有149页\编于星期五\3点滚环型（rollingcircle）如ФX174当前第73页\共有149页\编于星期五\3点D-环形（D-loop）如哺乳动物线粒体DNA当前第74页\共有149页\编于星期五\3点2.4原核生物和真核生物DNA复制的特点当前第75页\共有149页\编于星期五\3点2.4.1原核生物DNA复制的特点1DNA复制的引发oriC(84min)（dnaA结合位点）复制原点,Theoriginofreplication当前第76页\共有149页\编于星期五\3点不同原核生物的复制起始位点当前第77页\共有149页\编于星期五\3点Abacterialartificialchromosome(BAC)isaDNAconstruct,basedonafunctionalfertilityplasmid(orF-plasmid),usedfortransformingandcloninginbacteria,usuallyE.coli.F-plasmidsplayacrucialrolebecausetheycontainpartitiongenesthatpromotetheevendistributionofplasmidsafterbacterialcelldivision.Thebacterialartificialchromosome'susualinsertsizeis150-350kbp.扩展：BAC当前第78页\共有149页\编于星期五\3点Theeight-plasmidpolI–polIIsystemforthegenerationofinfluenzaAvirus.当前第79页\共有149页\编于星期五\3点dnaA与OriC的结合启动了DNA的复制NatureReviewsMicrobiology

11,303–315

(2013)当前第80页\共有149页\编于星期五\3点HU+ATP当前第81页\共有149页\编于星期五\3点RNA引物：所有的DNA聚合酶都从3’羟基端开始DNA合成。DNA复制首先需要由引发酶在DNA模板上合成一段RNA链，提供引发末端。长度11±1。引发体primosome引发前体preprimosome引发酶Primase(DnaG)DnaBhelicaseDnaChelicaseassistantDnaTPriAPriBPriC当前第82页\共有149页\编于星期五\3点2DNA双螺旋的解旋DNA解链酶(DNAhelicase)需要水解ATP获得能量。大部分沿模板的5’-3’方向移动，少数沿3’-5’方向移动(Rep蛋白)。在Ecoli中，解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸。当前第83页\共有149页\编于星期五\3点单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB蛋白)原核生物SSB蛋白有协同效应。防止单链DNA退火。使DNA单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨架结合，离开暴露的碱基——那些碱基能作为DNA合成的模板；使解开的单链不形成发卡结构；保护DNA单链不受Dnase水解。当前第84页\共有149页\编于星期五\3点DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)第一型拓朴异构酶（TypeItopoisomerase）：切断一股DNA，属于这类型的有拓朴异构酶I与拓朴异构酶III等。第二型拓朴异构酶（TypeIItopoisomerase）：切断双股DNA，属于这类型的有拓扑异构酶IIα与拓扑异构酶IIβ等。当前第85页\共有149页\编于星期五\3点扩展：TOPOCloning当前第86页\共有149页\编于星期五\3点3

复制的延伸冈崎片段与半不连续复制冈崎片段(Okazakifragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。前导链Leadingstrand后随链Laggingstrand然后，RNaseH（大肠杆菌中为DNA聚合酶I）降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。当前第87页\共有149页\编于星期五\3点当前第88页\共有149页\编于星期五\3点4复制的终止Tus与约22bp的终止序列Ter结合，使dnaB不再解链。当复制叉前移，遇到重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNAPNAS

September2,2008

vol.105

no.3512831-12836当前第89页\共有149页\编于星期五\3点当前第90页\共有149页\编于星期五\3点5DNA聚合酶所有DNA聚合酶（无论是原核生物还是真核生物来源）共同性质：(a)在DNA聚合酶的活性中心，在模板DNA链的指导下，按照碱基互补配对原则对新加入的碱基具有严格地选择；(b)新和成链的延伸方向是由5’→3’进行，新生链与模板链反向平行。(c)DNA聚合酶不能从头开始合成—所有的DNA聚合酶都需要一段寡聚核苷酸引物，（有3’-OH），在引物的3’-端逐个加入新的核苷酸。当前第91页\共有149页\编于星期五\3点细菌中，已有五种DNA聚合酶被发现。*DNA聚合酶I（PolI）：C端(Klenow片段)具有聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性；N端具有5‘-3’外切酶活性；能去除冈崎片段5‘端得RNA引物；有内切酶活性。*DNA聚合酶II（PolII）：活性低，在DNA损伤修复中起作用。*DNA聚合酶III（PolIII）：活性强，具有聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性，在大肠杆菌DNA复制过程中起主要作用。*DNA聚合酶IV（PolIV）：SOS修复中发挥作用。*DNA聚合酶V（PolV）：SOS修复中发挥作用。当前第92页\共有149页\编于星期五\3点Onlywhenacorrectbasepairisformedarethe3'OHoftheprimer

andtheα-phosphateoftheincomingnucleosidetriphosphateintheoptimumpositionforcatalysistooccur.当前第93页\共有149页\编于星期五\3点InDNApolymerase,thenucleotidebindingpocketistoosmalltoallowthepresenceofa2’OHontheincomingnucleotide.Thisspaceisoccupiedbytwoaminoacids(discriminatoraminoacids)thatmakevanderWaalscontactswiththesugarring.当前第94页\共有149页\编于星期五\3点DNAPolymeraseHoloenzymeConsistsofSubcomplexesAclamploaderplacestheprocessivitysubunitsonDNA,wheretheyformacircularclamparoundthenucleicacid.Onecatalyticcoreisassociatedwitheachtemplatestrand.DNApolymeraseIIIholoenzymeassemblesinstages,generatinganenzymecomplexthatsynthesizestheDNAofbothnewstrands当前第95页\共有149页\编于星期五\3点clamp当前第96页\共有149页\编于星期五\3点TheClampControlsAssociationofCoreEnzymewithDNAThecoreontheleadingstrandisprocessivebecauseitsclampkeepsitontheDNA.Theclampassociated withthecoreonthe laggingstrand dissociatesattheendof eachOkazakifragment andreassemblesforthe nextfragment.Thedimericpolymerasemodel当前第97页\共有149页\编于星期五\3点当前第98页\共有149页\编于星期五\3点扩展：双链DNA上的单链切口可以激活DNA聚合酶Ｉ的５‘→３’的外切酶活力，从切口的５‘切去核苷酸，同时从切口开始合成新链，可使DNA链上切口向前推进，产生切口平移。切口平移时，如果新掺入的脱氧核苷三磷酸为α－３２ｐ－ｄＮＴＰ，则重新合成的新链为带有同位素标记的ＤＮＡ分子，可以用做探针进行分子杂交实验。当前第99页\共有149页\编于星期五\3点2.4.2真核生物DNA复制的特点真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。真核生物复制原核生物复制当前第100页\共有149页\编于星期五\3点复制起始位点：自主复制序列(autonomousreplicatingsequence,ARS)这个序列是染色体正常起始复制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列。当前第101页\共有149页\编于星期五\3点ARS能结合起始点识别复合物(originrecognitioncomplex,ORC)。a|Theoriginrecognitioncomplex(ORC)isfirstrecruitedtothereplicationorigin.b|ORCrecruitsCdc6andCdt1.c|ORC,Cdc6andCdt1acttogethertoloadmultipleminichromosomemaintenance(Mcm)2–7proteinhexamersontotheorigin,whichlicensestheDNAforreplication.d|Initiation-competentcomplexesareprobablyformedbytheback-to-backassemblyoftwoMcm2–7complexes.AstheORCisasymmetrical,thismightrequiredepositionofasecondORCmoleculetoloadMcm2–7intheoppositeorientation.NatureReviewsMolecularCellBiology6,476-486(June2005)当前第102页\共有149页\编于星期五\3点真核细胞染色体ＤＮＡ的各个区域不是全部同时复制的，Ｓ期中不断有复制子被活化，直至整个染色体完全复制。在真核生物基因组复制过程中，只有部分复制位点起作用，这可能与染色体结构、基因转录、生物发育过程、ＤＮＡ的甲基化等因素有关。例如，动物发育过程中，细胞周期的Ｓ期在胚胎期可以只有几分钟，在成熟组织中长达几小时。ＤＮＡ复制在Ｓ期的及时完成主要取决于有效复制起始位点的增加，而不是复制叉移动速度的增加。当前第103页\共有149页\编于星期五\3点已发现15种真核DNA聚合酶，在哺乳动物细胞中有5种：Polα：做为引发酶合成RNA引物，然后做为DNA合成酶延伸此段RNA引物；合成数百个碱基后，将后续的延伸过程交给Polδ与ε。Polβ：在DNA修复中起作用。Polγ：复制线粒体DNA。Polδ：Polδ与Polε是真核细胞的主要DNA聚合酶。（前导链）Polε：填补引物空隙，切除修复，重组。（冈崎片段）

（真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性，推测有其他的酶参与校对。）去除冈崎片段：分两步，RNA酶H1切断DNA-RNA，FEN1蛋白降解RNA片段，DNA连接酶连接两个冈崎片段。当前第104页\共有149页\编于星期五\3点2.4.3DNA复制的调控大肠杆菌染色体DNA的复制调控 复制起始不依赖于细胞分裂，复制终止则能引发细胞分裂。复制调控主要发生在起始阶段。

对dam-E.Coli的研究表明，半甲基化的OriC不能发动一轮新的复制 在复制过程中，OriC的半甲基化状态约保留13min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5min内即被甲基化。当前第105页\共有149页\编于星期五\3点当前第106页\共有149页\编于星期五\3点ColE1质粒DNA的复制调控引物RNA前体的转录起始于复制起点上游555个核苷酸处，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3’末端起始DNA合成。RNA1的编码区在引物RNA编码区的5’末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5’末端互补。RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负调控作用。（负调控）当前第107页\共有149页\编于星期五\3点当不存在RNA1时，RNA引物前体形成自身的发夹结构，起类似终止子的作用当前体RNA与RNA1互补配对时，类终止子效应消失，引物前体的转录被继续，阻止了RNaseH加工引物前体Rop蛋白能提高RNA1与引物前体的相互作用，从而加强了RNA1的负调控作用当前第108页\共有149页\编于星期五\3点3.真核细胞DNA的复制调控（1）细胞生活周期水平调控DNA复制只发生在S期

S期的主要事件是DNA复制，该过程将准确生成两套半保留的染色体。对此，有人提出“DNA复制执照”假说，该假说认为细胞中存在一种因子使DNA仅能复制一次。且该因子将不断降解从而使DNA复制于G2期中止，并直至下一次M期重新接触到该因子才可继续复制。有实验证明Mcm、Orc蛋白等成分构成了执照因子。（2）染色体水平调控不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定的时间顺序在S期起始复制。机理还不清楚。（3）复制子水平调控

各个复制子按专一的时间顺序活化。

当前第109页\共有149页\编于星期五\3点Thecelldivisioncycleanditscontrol.Thecellcycleisdividedintofourdistinctphases(G1,S,G2,andM).TheprogressionofacellthroughthecellcycleispromotedbyCDKs,whicharepositivelyandnegativelyregulatedbycyclinsandCKis,respectively.Asshown,cyclinDisoformsinteractwithCDK4andCDK6todrivetheprogressionofacellthroughG1.CyclinD/CDK4,6complexesphosphorylatepRb,whichreleasesE2Ftotranscribegenesnecessaryforcellcycleprogression.TheassociationofcyclinEwithCDK2isactiveattheG1-StransitionanddirectsentryintoS-phase.TheINK4sbindandinhibitcyclinD-associatedkinases(CDK4andCDK6).ThekinaseinhibitorproteingroupofCKi,p21Cip1/Waf-1,p27Kip1,andp57Kip2,negativelyregulatecyclinD/CDK4,6andcyclinE/CDK2complexes.S-phaseprogressionisdirectedbythecyclinA/CDK2complex,andthecomplexofcyclinAwithCdk1isimportantinG2.CDK1/cyclinBisnecessaryfortheentryintomitosis.CurcuminmodulatesCKis,CDK-cyclinandRb-E2FcomplexestorenderG1-arrestandaltersCDK/cyclinBcomplexformationtoblockG2/Mtransition.SaandDasCellDivision20083:14doi:10.1186/1747-1028-3-14当前第110页\共有149页\编于星期五\3点当前第111页\共有149页\编于星期五\3点2.5DNA的修复维持DNA序列的保真性；可在复制前后进行；有多种修复机制来纠正DNA损伤；DNA修复失败可能导致突变和肿瘤。当前第112页\共有149页\编于星期五\3点怎么损伤的？1自发损伤DNA复制中的错误（10-1~-2->10-5~-6->10-10）DNA自发性化学变化（碱基异构、脱氨基、脱嘌呤嘧啶、碱基修饰）2物理因素紫外线电离辐射3化学因素烷化剂碱基类似物（5-溴尿嘧啶……）EB当前第113页\共有149页\编于星期五\3点mismatchrepair(MMR)–Atypeofrepairthatcorrectsmispairedbases,typicallyimmediatelyfollowingreplication.Theprocesspreferentiallycorrectsthesequenceofthedaughterstrandbydistinguishingthedaughterstrandandparentalstrand,sometimesonthebasisoftheirstatesofmethylation.Thehumangenomehasmanyrepairgenes修复方式概览当前第114页\共有149页\编于星期五\3点2.5.1错配修复当前第115页\共有149页\编于星期五\3点当前第116页\共有149页\编于星期五\3点2.5.2切除修复AP位点所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能够特异性切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点(apurinic/apyrimidinicsite)。AP位点AP核酸内切酶DNA聚合酶IDNA连接酶1.碱基切除修复当前第117页\共有149页\编于星期五\3点当前第118页\共有149页\编于星期五\3点2.核苷酸切除修复当前第119页\共有149页\编于星期五\3点2.5.3重组修复有时在进行DNA修复之前，受损环的DNA链常常还能进行复制。在这种情况下，受损亲代链的复制受损坏碱基的干扰，跨过这段损坏序列后，此时在新的一个起点继续开始复制，此时新合成的子代链的碱基序列就有了一个缺口。这种缺口可以通过重组修复机制纠正。这种修复机制有点类似于遗传重组。

当进行第二轮复制时，如果损伤还留在母链上，仍会给复制带来困难，复制经过损伤部位时所产生的缺口还需通过同样的重组过程来弥补，直至损伤被切除修复所消除。但是，随着复制的不断进行，若干代后，即使损伤始终未从亲代链中除去，而在后代细胞群中也已被稀释，实际上消除了损伤的影响。当前第120页\共有149页\编于星期五\3点2.5.4DNA的直接修复当前第121页\共有149页\编于星期五\3点当前第122页\共有149页\编于星期五\3点当前第123页\共有149页\编于星期五\3点2.5.5SOS反应SOS修复（SOSresponse）是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-pronerepair），使细胞有较高的突变率。在SOS修复中，可以诱导产生校对功能低的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，合成的新的DNA链是不忠实的，有许多不配对的碱基，而复制仍可进行。往往导致突变的产生，但对细胞来说，比根本不能存活要好。在此情况下允许错配可增加存活的机会。

当前第124页\共有149页\编于星期五\3点DamagetoDNAcausesRecAtotriggertheSOSresponse,whichconsistsofgenescodingformanyrepairenzymes.RecAactivatestheautocleavageactivityofLexA.LexArepressestheSOSsystem;itsautocleavageactivatesthosegenes.LexAandRecAhaveareciprocallyantagonisticrelationshipRecATriggerstheSOSSystem当前第125页\共有149页\编于星期五\3点SOSresponseinE.coli

当前第126页\共有149页\编于星期五\3点2.6DNA的转座转座子的定义:能将自身插入基因组新位置的DNA序列。当前第127页\共有149页\编于星期五\3点当前第128页\共有149页\编于星期五\3点2.6.1转座子的分类和结构特征每个IS转座频率是10-4~10-6/世代，恢复频率则低得多，约为10-10~10-6/世代。插入序列（insertionalsequence,IS）

当前第129页\共有149页\编于星期五\3点（1）含短的末端反向重复序列;（2）含编码转座酶的基因;（3）靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。插入序列的结构特征当前第130页\共有149页\编于星期五\3点2.复合型转座子（compositetransposon）

当前第131页\共有149页\编于星期五\3点当前第132页\共有149页\编于星期五\3点TheorderofeventsandexactnatureoftheconnectionsbetweentransposonandtargetDNAdeterminewhethertranspositionisreplicativeornonreplicative.TransposoniscopiedtonewsiteTransposonmovestonewsite当前第133页\共有149页\编于星期五\3点2.6.2真核生物中的转座子当前第134页\共有149页\编于星期五\3点2.6.2真核生物中的转座子自主性转座子（autonomoustransposon）：具有自主剪接和转座功能。非自主性转座子（nonautonomous