色谱分析法概论

色谱分析法概论第一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法的由来色谱法的创始人－俄国植物学家茨维特(M.Tswett)第二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法的由来在茨维特的实中：装有CaCO3的玻璃管

——色谱柱

CaCO3

——固定相纯石油醚

——流动相

第三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法的由来

在该实验中，碳酸钙上混合色素被分成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱现象一样，因此茨维特把这种现象称为色谱，相应的分离方法称为色谱法（色层法，层析法）

第四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一高分离效能、高灵敏度、高选择性、分析速度快、应用范围广色谱法的特点:第五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱学的重要作用诺贝尔化学奖：1948年，瑞典提塞留斯

(Tiselius)，电 泳和吸附分析；1952年，英国马丁 (Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。应用的科学领域：生命科学、材料科学、环 境科学等。（科学的科学）药学（药物分析）：各国药典收载了许多色 谱分析方法。中国药典二部，700多，纯 度检查、定性鉴别或含量测定，一部， 600多鉴别或含量测定。中药复方制剂质量测检和中药配伍中的应用

第六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法实质是分离色谱分离的基本条件：

1.互不相溶的两相（流动相、固定相）；

2.被分离组分在两相之间作相对运动第七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

色谱法实质—分离分离依据：

各组分在两相之间作用力不同(吸附能力分配系数离子交换能力大小排阻能力其他亲合作用)各组分差速异行→分离第八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法分类按两相状态分

第九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法分类按分离过程机制分

吸附色谱法—利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异分配色谱法—组分在两相中分配系数不同

离子交换色谱法—利用离子交换原理

排阻色谱法—利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用

等等第十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法分类按固定相的固定形式分第十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱法分类附：根据所使用的技术不同分

高效液相色谱(HPLC)

化学键合相色谱衍生气相(液相)色谱裂解色谱顶空气相色谱色谱制备色谱分析第十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第二节色谱过程

一、色谱过程

实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)。

色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。第十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱过程组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。第十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一1.气相色谱分离过程

当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;

随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;

挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;

随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。第十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;

随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;第十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱图

被分析试样从进样开始，经色谱柱分离，到各组分全部流过检测器在此期间所记录下来的响应信号随时间而变化的曲线（分布的图像），称为色谱流出曲线或色谱图。色谱图及常用术语第十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一色谱峰

在一定色谱条件下，组分通过检测器时，响应信号随时间而变化的曲线称为色谱峰。

色谱过程按近理想条件和分配系数恒定时的流出曲线为对称的高斯分布曲线，对应的高斯分布函数为：色谱图及常用术语第十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一基线在色谱操作条件下仅有流动相通过检测器时，反映检测器噪声随时间变化的曲线。稳定的基线是一条直线。第二十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一峰高

从色谱峰顶点到基线的距离第二十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一区域宽度

1.峰底宽度在色谱峰两边的转折点(也叫拐点即EF)所画的切线与基线相交的截距。两个拐点E和F之间的距离为

EF=，分别位于处。第二十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一区域宽度2.半峰宽

峰高一半处的宽度GH第二十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一3.标准偏差σ两个拐点E和F之间的距离的一半

4.峰面积A色谱峰与基线延长线所包围的面积，精确计算时

第二十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一保留值的定义1.保留时间从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间第二十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一保留值的定义2.死时间不被固定相保留的组分，从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间。(空气、甲烷或乙醚峰的保留时间）。实际上为流动相流经色谱柱所需要的时间：——柱长（cm)——流动相平均线速度(cm/s)第二十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一保留值的定义3.调整保留时间

组分的保留时间与死时间之差第二十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

色谱保留值

表明色谱峰在色谱图中的位置（可用时间t、体积V、距离d表示）。它是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。色谱常用术语第二十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一保留值的定义

4.保留体积从进样开始到色谱峰最大值出现时所需通过的流动相的体积

5.死体积

6.调整保留体积在LC中为实测值（mL/min)在GC中为校正到柱稳住压下的平均流速第二十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一相对保留值

某一组分与基准物质的调整保留值之比：第三十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一总分离效能指标分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色 谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。第三十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一设正常峰，W1≈W2=4σ

，则R=1.5时，99.7%面积(tR

±3σ)被分开，∆

tR=6σ

，称6σ分离

。R＜1,峰重叠，未分开R=1,认为基本分开，4σ分离R=1.5,两峰完全分离，6σ分离第三十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一三、分配系数与色谱分离(一)分配系数和容量因子

分配系数

(distributioncoefficient；K)是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。第三十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一容量因子(capacityfactor；k)：在一定温度和压力 下，达到分配平衡时，组分在固定相和流 动相中的质量(m)之比。（摩尔数？）又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分离还与固定相和流动相的体积有关。容量因子与分配系数的关系第三十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一tR=t0(1+k)tR=t0(1+K)分配系数与色谱分离（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系v=L/tRu=L/t0第三十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（三）色谱分离的前提KA≠KB

或kA≠kB

是色谱分离的前提。=t0(1+KA)=t0(1+KB)

tR=t0(KA－KB)tR≠0KA≠KBkA≠kB分配系数与色谱分离推导过程：第三十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；

（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；

（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；

第三十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

塔板理论的假设：

(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；

(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；

(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；

(4)每次分配的分配系数相同。10-2-1塔板理论-柱分离效能指标

1.塔板理论（platetheory）半经验理论；

将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复

（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；第三十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

色谱柱长：L，

虚拟的塔板间距离：H，

色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H

理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!第三十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一2.有效塔板数和有效塔板高度

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：

第四十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一3.塔板理论的特点和不足(1)当色谱柱长度一定时，塔板数

n

越大(塔板高度

H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。

(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。

第四十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一10-2-2速率理论-影响柱效的因素1.速率方程

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，

u：载气的线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提高柱效；

存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？第四十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。第四十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一B/u—分子扩散项

B=2νDgν

：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。

Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;

(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;

(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；

M载气↑，B值↓。第四十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

k为容量因子；

Dg

、DL为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。C·u—传质阻力项

传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：

C=（Cg+CL）第四十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一2.载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。

以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。第四十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一3.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。

第四十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一10-2-3分离度

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。

色谱分离中的四种情况如图所示：第四十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

色谱分离中的四种情况：①

柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②

△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，，△K较大,但分离的不好；④

△K小，柱效低，分离效果更差。第四十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。第五十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：第五十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（1）分离度与柱效

分离度与柱效的平方根成正比，r21一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。（2）分离度与r21

增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。第五十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一例题1：

在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：

r21=100/85=1.18

n有效

=16R2[r21/(r21—1)]2=16×1.52

×(1.18/0.18)2

=1547（块）

L有效

=n有效·H有效

=1547×0.1=155cm

即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。第五十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一例题2：

在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。解：分离度：

塔板数增加一倍，分离度增加多少？

第五十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第三节基本类型色谱方法分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法第五十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一一、分配色谱法第五十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一分配色谱法分离原理

利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。第五十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一分配色谱法固定相又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。

正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。

第五十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一分配色谱法洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解 度的相对大小而决定。正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。 （库仑力和氢键力）反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。第五十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一二、吸附色谱法分离原理

利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。第六十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。第六十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一吸附色谱法固定相多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等第六十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一吸附色谱法流动相有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。第六十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一表17-1一些溶剂在硅胶上的o值溶剂

溶剂强度（o）溶剂

溶剂强度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70第六十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一吸附色谱法洗脱顺序

ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。第六十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。①饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。②基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)。③不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。④分子中取代基的空间排列第六十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一三、离子交换色谱法分离原理利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式：交换再生++3RNR+OH-ClRNR+3ClOH交换再生++RSOH+Na+Na++33HRSO第六十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一四、空间排阻色谱法分离原理

根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离。 也称为分子排阻色谱法。第六十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一空间排阻色谱法

根据空间排阻（stericexclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数：

Kp=Xs/Xm

（0＜Kp＜1

）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。第六十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质主要性能参数平均孔径排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。第七十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一空间排阻色谱法流动相

要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gelfiltrationchromatography；

GFC)；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相(凝胶渗透色谱gelpermeationchromatography；GPC)。第七十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一空间排阻色谱法保留体积与渗透系数的关系Vm≈V0分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。第七十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。第七十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一10-3-1色谱定性分析1.利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

第七十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

2.利用文献保留值定性

利用相对保留值r21定性

相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

第七十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一3.保留指数

又称Kovats指数(Ⅰ)，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：第七十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一保留指数计算方法第七十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一4.与其他分析仪器联用的定性方法

小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS