荧光分光光度法与检测技术

荧光分光光度法与检测技术1第一页，共四十三页，编辑于2023年，星期一◆学习目的通过学习荧光分析法的基本原理，产生荧光的条件以及荧光光谱特征和用途，加深对荧光分析的依据、条件和应用的理解，并能选择荧光物质的激发波长和荧光波长进行分析。为学习药物分析、天然药物化学等专业课程奠定基础。2第二页，共四十三页，编辑于2023年，星期一◆知识要求熟悉掌握荧光和磷光产生的原理和特点及区别；激发光谱与荧光光谱的概念及用途；溶液荧光光谱的特征；产生荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件和方法。了解。了解影响荧光强度的因素，荧光分析仪器及其与紫外-可见分光光度计的区别，荧光分析新技术在分析中的应用。3第三页，共四十三页，编辑于2023年，星期一◆能力要求掌握荧光分光光度计的基本结构及仪器的基本操作方法，学会使用荧光分光光度计对药物进行分析的操作技术。4第四页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节荧光分光光度法的基本原理

某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这种发射光称为荧光（fluorescence）。荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又称荧光光谱法5第五页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理一、荧光的产生过程（一）单重态与三重态A单重基态B激发单重态C激发三重态6第六页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（二）荧光的产生电子由激发单重态→基态单重态的跃迁7第七页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（二）磷光的产生电子由激发三重态→基态单重态的跃迁课堂互动您能比较荧光和磷光的主要区别吗？8第八页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）9第九页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。10第十页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质所产生的荧光通过发射分光系统(II)分光，测定每一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。11第十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理溶液荧光光谱具有如下特征：斯托克斯位移荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱的镜像关系蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）12第十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理三、荧光与分子结构（一）荧光物质的特征具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收具有高的荧光效率荧光效率13第十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（二）分子结构与荧光的关系大的共轭π键结构λex（激发）λem（激发）φF苯2052780.11萘2863210.29蒽3654000.46四苯3904800.6014第十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理分子的刚性和共平面性取代基的影响联苯φF=0.18芴F=1.0

15第十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（三）影响荧光强度的外界因素温度溶剂溶液酸碱性荧光熄灭剂散射光激发光源16第十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（四）荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。17第十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（一）仪器类型滤光片荧光计滤光片-单色器荧光计荧光分光光度计18第十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（二）荧光分光光度计的基本结构1.光源2.4.7.9.狭缝3.激发单色器5.样品池6.表面吸光物质8.发射单色器10.检测器11.放大器12.指示器13.记录器19第十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理光源目前最常用的是氙灯单色器（分光系统）激发单色器发射单色器样品池测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英检测器光电倍增管20第二十页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第一节基本原理（三）仪器校准灵敏度校准波长校准激发光谱和发射光谱校准21第二十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期一课堂互动请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别第一节基本原理22第二十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期一点滴积累荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性依据，也是定量测定时的最适宜波长。强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构，如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。第一节基本原理23第二十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析第二节荧光定量分析由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同，发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。24第二十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析一、荧光强度与物质浓度的关系

当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸收光的强度：F∝（I0–I），用线性方程表示为：F=K′（I0–I）25第二十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：F=2.303·φF·I0·ε·c·L入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定值，因此可以将2.303·φF·I0·ε·L视为常数K，故：F=Kc26第二十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的依据。但只有当荧光物质的浓度很小时，即ε·c·L≤0.05，这种关系才成立。27第二十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期一课堂互动请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度比紫外-可见分光光度法要高？第二节荧光定量分析28第二十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析二、定量分析方法标准曲线法

配制一系列浓度为c1、c2、c3……对照品溶液，分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲线。然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准曲线上查找对应的浓度cx。29第二十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析比例法

若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx），然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：30第三十页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第二节荧光定量分析多组分混合物测定与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外-可见分光光度法广泛。31第三十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期一点滴积累当其他条件（即φF、I0、ε、L）一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。第二节荧光定量分析32第三十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第三节应用与发展一、荧光分析的应用（一）有机化合物的荧光分析芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系在紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度和选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。第三节应用与发展33第三十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第三节应用与发展（二）无机化合物的荧光分析直接荧光法荧光猝灭法催化荧光法34第三十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第三节应用与发展二、荧光分析新技术激光荧光分析时间分辨荧光分析同步荧光分析胶束增敏荧光分析三维荧光光谱分析原油试样在环乙烷中的等角三维投影光谱图35第三十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第八章荧光分析法检测技术与应用一、选择题(一)单项选择题1.荧光光谱属于（）。A、吸收光谱B、发射光谱C、红外光谱D、质谱2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。A、能发射荧光的物质比较少B、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱C、荧光波长比相应的吸收波长稍长D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰目标检测36第三十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期一37第八章荧光分析法检测技术与应用3.荧光量子效率是指（）。A、荧光强度与吸收光强度之比B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比D、激发态的分子数与基态的分子数之比4.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。A、分子结构B、激发光的波长C、温度D、溶剂的极性第三十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第八章荧光分析法检测技术与应用5.下列叙述中，错误的是（）。A、荧光分析的待测物应含有大π键B、紫外分光光度法待测物应含有π键C、质谱法待测物应含离子D、气象色谱分析物的沸点应较低6.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。A、激发光强度下降B、溶剂极性变小C、温度下降D、溶剂中含有卤素离子38第三十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期一39第八章荧光分析法检测技术与应用7.荧光波长与相应激发光波长相比（）。A、前者较长B、后者较长C、两者相等D、关系不确定8.荧光光谱分析的主要优点是（）。A、准确度高B、操作简便C、仪器简单D、灵敏度高9.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。A、光源B、单色器C、光路D、检测器第三十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第八章荧光分析法检测技术与应用（二）多项选择题1.下列关于分子荧光分析特点的叙述正确的是（）。A、检测灵敏度高B、用量大，分析时间长C、用量少，操作简便D、选择性强E、应用广泛2.分子中有利于提高荧光效率的结构特征是（）。A、双键数目较多B、共轭双键数目较多C、含重金属原子D、分子为平面刚性E、苯环上有给电子基团40第四十页，共四十三页，编辑于2023年，星期一41第八章荧光分析法检测技术与应用3.下列跃迁方式属于无辐射跃迁的有（）。A、振动弛豫B、内转换C、体系间跨越D、荧光发射E、磷光发射4.分子荧光法与紫外-可见分光光法的主要区别为（）。A、分析方法不同B、仪器结构不同C、灵敏度不同D、光谱带个数不同E、光源不同第四十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期一第八章荧光分析法检测技术与应用二、填空题1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为

；荧光波长固定后，荧光强度与激发