血清蛋白聚丙烯酰胺电泳

血清蛋白聚丙烯酰胺电泳第一页，共三十一页，编辑于2023年，星期一一、实验目的＊学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理＊掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术第二页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(一)电泳的含义

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。

电泳的应用

1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等

2.分析某种物质的纯度及分子量

3.电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析

4.免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力二、实验原理第三页，共三十一页，编辑于2023年，星期一第四页，共三十一页，编辑于2023年，星期一待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。电泳的影响因素第五页，共三十一页，编辑于2023年，星期一支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性；缓冲液通常要保持一定的离子强度，强度过低，则缓冲能力差，不易维持pH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。第六页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳

以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法,由丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产生的方法有两种：化学法和光化学法.第七页，共三十一页，编辑于2023年，星期一1.凝胶聚合催化体系

化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称AP）。在催化剂N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，由AP形成氧自由基而引发聚合反应，由于反应需要TEMED的游离碱基，所以在低pH下，聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。第八页，共三十一页，编辑于2023年，星期一

（1）光催化：核黄素

（2）化学催化：AP-TEMED催化体系TEMED（四甲基乙二胺）催化AP（过硫酸胺）生成硫酸自由基：S2O82－

2SO4·¯硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：第九页，共三十一页，编辑于2023年，星期一Bis将单体长链间连成网状结构：

第十页，共三十一页，编辑于2023年，星期一

化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：•

催化剂和加速剂的浓度•

pH

碱性条件•

温度

•

分子氧•

杂质第十一页，共三十一页，编辑于2023年，星期一分子量范围

适用的凝胶浓度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系2.凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关

第十二页，共三十一页，编辑于2023年，星期一

3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。第十三页，共三十一页，编辑于2023年，星期一4.聚丙烯酰胺凝胶种类(1)连续系统与不连续系统两大类

不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。

(2)常用的多为圆盘电泳和板状电泳，原理完全相同。第十四页，共三十一页，编辑于2023年，星期一

(3)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。第十五页，共三十一页，编辑于2023年，星期一

1)样品浓缩效应

A.凝胶孔径不连续性

B.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性

C.电位梯度的不连续性

2)分子筛效应

3)电荷效应(4)不连续体系凝胶对蛋白的分离作用第十六页，共三十一页，编辑于2023年，星期一三.实验器材1、电泳仪,电泳槽及其附件2、培养皿3、脱色摇床4、烧杯5、移液枪6、吸量管7、枪头等第十七页，共三十一页，编辑于2023年，星期一四.实验试剂

(参考P121)人血清；分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液PH8.9；浓缩胶缓冲液:Tris-HCl缓冲液PH6.7；分离胶贮液:Acr28.0g,Bis0.735g,无离子水溶解定容至100ml；浓缩胶贮液:Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至100ml；1.6%过硫酸铵溶液:1.6g过硫酸铵溶于100ml无离子水中；电泳缓冲液:Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3,用时稀释10倍；1%考马斯亮蓝G-250；6%乙酸溶液；40%蔗糖溶液；0.1%溴酚蓝溶液

第十八页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(一)垂直平板电泳槽的安装(二)凝胶的制备(三)加样(四)电泳(五)固定和染色(六)脱色五.操作步骤第十九页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(一).垂直平板电泳槽的安装第二十页，共三十一页，编辑于2023年，星期一第二十一页，共三十一页，编辑于2023年，星期一

(二).凝胶的制备名称分离胶缓冲液分离胶贮液1.6%过硫酸胺（AP）无离子水体积比例1（2号）2（4号）1（6号）4取量mL1214分离胶的制备(7%)配8mL迅速混匀取6mL沿壁加样,基本上加到2/3处,再取大约3mL水加在上面补满覆盖室温静置30min(烘箱37度,凝聚速度快)第二十二页，共三十一页，编辑于2023年，星期一名称浓缩胶缓冲液浓缩胶贮液1.6%过硫酸胺（AP）40%蔗糖体积比例1（3号）2（5号）1（6号）4(9号）取量mL0.510.522.浓缩胶的制备(2.5%)配4mL迅速混匀,取3mL沿壁连续平稳加样到分离胶上面,直至离边缘5mm处,迅速插入加样梳,室温或37度烘箱静置一段时间.※加样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

凝聚后倒出上层的水,用小滤纸条吸去表面水分第二十三页，共三十一页，编辑于2023年，星期一凝胶凝聚后，垂直拔出加样梳，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体。第二十四页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(三).进样将凝胶板放在电泳槽内，加入稀释10倍的Tris－甘氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm,即可加样．※要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

注意短玻璃板是向内侧的。第二十五页，共三十一页，编辑于2023年，星期一取血清样品0.1ml,40%蔗糖溶液0.2ml,0.05%溴酚蓝溶液0.05ml混合后，用微量注射器取上述混合液，通过缓冲液，距凝胶凹形样品槽底三分之一处进样,待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。每个同学可做梯度上样,

10μl．※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,否则在样品下沉时会发生扩散.第二十六页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(四).电泳将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（方向切勿接错）将电泳缓冲液倒入电泳外槽，打开电泳仪开关，开始时将电压调至150－200V，待样品进入分离胶时，将电压调至300V。当蓝色染料迁移至距离橡胶下缘1cm时，关掉电源，停止电泳。第二十七页，共三十一页，编辑于2023年，星期一电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.

第二十八页，共三十一页，编辑于2023年，星期一(五).固定和染色将凝胶放入1%考马斯亮蓝G-250（内含6%乙酸）染色液中，使染色液没过胶板，放到摇床上，染色5min左右。(六).