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燕山大学课程设计说明书银耳多糖的提取与纯化工艺的设计学院(系):里仁学院建环系年级专业: 10级生物制药学号: 姓名: 教师: 教师职称: 副教授

燕山大学课程设计(论文)任务书院(系):里仁学院 基层教学单位:建环系学号101610051006学生姓名韩雨薇专业(班级)10级生物制药设计题目银耳多糖的提取与纯化工艺的设计设计主要内容银耳多糖提取条件的单因素实验银耳多糖提取条件的正交实验设计要求要有明确设计的目的设计合理的操作方式设计出合理的测定指标设计的内容要与题目基本一致设计总结与分析工作量至少阅读15篇以上的相关科技文献设计文字至少在10000字以上工作计划12.9-12.11 查阅资料,整理文献12.12 提出设计方案12.13-12.17 撰写说明书12.18-12.19 检查内容,准备答辩12.20 答辩参考资料[1]林宇野,杨虹.酶法提取银耳多糖的研究[J].食品与发酵工业,1995(1):13-17⑵吴琼,郑成,等.微波辅助萃取银耳多糖的研究[J].食品科技,2006(9):109-111[3]顾回美,赵伯涛,等.挤压处理银耳子实体对多糖提取效果的影响[J].食品科学,2011,32(11):83-86指导教师签字崔洪霞基层教学单位主任签字崔洪霞说明:学生、指导教师、基层教学单位各一份。2013年12月2日

设计者姓名:—韩雨薇 学号:一101610051006 设计题目:__银耳多糖的提取与纯化.工艺的设计 说明书评分:设计思路:20分字数要求:20分文档排版:20分格式细节:20分分析讨论:20分成绩: 答辩小组评语:口语表达:满分20分幻灯质量:满分20分设计分析:满分40分回答问题:满分20分成绩: 课程设计总成绩:说明书成绩X0.5+答辩成绩X0.5)答辩小组成员签字:2013-2014秋季学期生物工程专业课程设计结题论文银耳多糖的提取与纯化工艺的设计学院(系): 里仁学院建环系年级专业:10级生物制药学号:101610051006学生姓名: 韩雨薇指导教师: 崔洪霞教师职称: 副教授摘要银耳多糖是银耳中的主要活性物质,来源于银耳子实体和银耳细胞深层发酵孢子中分离、纯化得到的杂多糖。现代医学和药理学的很多研究将银耳多糖的药用功效概括为提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖和降血脂等多种生理功能。本设计通过采用微波辅助提取法来提取银耳多糖。在微波提取系统中,影响多糖提取率的主要因素有三个:微波功率、加热时间、加热温度。针对这三个因素分别设计单因素实验,根据单因素实验得出最佳范围,然后再根据所得出的范围做三因素三水平的正交实验,从而得出最佳的提取条件组合。本文系统地综述了银耳多糖的化学组成、制备和提取纯化、生物活性、实际应用等方面的研究概况,并展望了其今后研究方向及开发应用前景。关键词:银耳多糖;提取;纯化目录第一部分文献综述TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"1、 银耳多糖简介 1\o"CurrentDocument"1.1银耳多糖的组成 11.1.1酸性杂多糖 11.1.2中性杂多糖 11.1.3胞壁多糖 21.1.4胞外多糖 21.1.5酸性低聚糖 2\o"CurrentDocument"2、 银耳多糖的提取及制备 2\o"CurrentDocument"2.1银耳多糖的提取方法 2\o"CurrentDocument"2.1.1浸提法 22.1.2超声波辅助提取法 32.1.3微波辅助提取法 42.1.4超临界流体萃取法 4\o"CurrentDocument"2.2银耳多糖的干燥方法 4\o"CurrentDocument"2.3银耳多糖生理活性试验 52.3.1银耳多糖清除羟自由基活性 52.3.2银耳多糖清除超氧阴离子自由基活性 52.3.3银耳多糖的抗氧化作用 5\o"CurrentDocument"3、 银耳多糖的功能特性 5\o"CurrentDocument"3.1在食品生产中的加工特性 5\o"CurrentDocument"3.2在化妆品生产中的加工特性 5\o"CurrentDocument"3.3银耳多糖的药理学特性 63.3.1免疫调节作用 63.3.2抗肿瘤作用 63.3.3降血糖、降血脂作用 63.3.4抗溃疡作用 6第二部分课程设计部分材料 8\o"CurrentDocument"实验仪器 8方法 8\o"CurrentDocument"3.1银耳多糖的微波提取 8\o"CurrentDocument"3.2银耳多糖的纯化 8\o"CurrentDocument"DEAE-SepharoseFastFlow柱层析分离 8\o"CurrentDocument"SephadexG-200凝胶过滤柱层析分离 93.3紫外吸收测定 9\o"CurrentDocument"3.4银耳多糖含量测定 9\o"CurrentDocument"设计 9\o"CurrentDocument"4.1银耳多糖提取条件的单因素实验 94.1.1微波功率对银耳多糖提取率的影响 94.1.2加热时间对银耳多糖提取率的影响 94.1.3加热温度对银耳多糖提取率的影响 10\o"CurrentDocument"4.2银耳多糖提取条件的正交实验 10\o"CurrentDocument"分析与总结 10\o"CurrentDocument"参考文献 12第一部分文献综述1、银耳多糖简介银耳多糖(Tremellapolysaccharides,TP)是银耳的重要活性成分(约占银耳干重的60%-70%),是从银耳子实体或液体深层发酵的银耳孢子中提取出来的一种活性多糖。银耳是木头上的腐生真菌,不能利用阳光进行光合作用,只能在腐生条件下依靠吸收腐朽树木中的养分而生长发育[1]。然而银耳在腐木上吸收养料只依靠自身是不行的,纯菌丝必须和一种生活力旺盛的香灰菌丝伴生,借助于香灰菌丝分解木材,提供营养物质。大量研究表明,从银耳中提取分离得到的银耳多糖具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、抗突变等作用,能增强机体耐缺氧能力,清除自由基⑵。我国银耳资源丰富,为开发应用银耳提供有利条件。随着银耳栽培业迅速发展及应用范围拓宽,对银耳营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。银耳多糖的功能特性也越来越受到关注[1]。1.1银耳多糖的组成银耳多糖的主链是由a-(1-3)-糖苷键组成的甘露聚糖,主链的2,4,6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及普通糖醛酸等残基组成的侧链,其活性中心是a-(1-3)-甘露聚糖这一共同结构部分。银耳多糖种类包括酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖和酸性低聚糖五种,不含核酸、蛋白质类物质⑶。1.1.1酸性杂多糖约占银耳总多糖的70%〜75%,为木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为主的多聚体,中有少量岩藻糖。Ukai等(1972)从银耳子实体中分离出3种酸性杂多糖A、B、C。这3种多糖主要是由木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成,也含有少量葡萄糖及微量岩藻糖⑶。1.1.2中性杂多糖约占银耳总多糖的20%左右,为木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的多聚体。Ukai等(1978)从银耳子实体中分离出一种中性杂多糖,无色粉末。不含N、P、S,主要由木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。1.1.3胞壁多糖sone等[3](1978)从银耳细胞壁中分离到2种胞壁多糖,其一是从胞壁外层产生的酸性多糖,由D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖和D-木糖组成;另一种为碱性多糖,由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖和D-木糖组成。1.1.4胞外多糖Kakuta等[3](1979)从银耳菌株T-19和T-7细胞培养液中分离到2种多糖。这2种多糖都含有D-葡萄糖醛酸,D-木糖和D-甘露糖及少量L-岩藻糖和0-乙酰基。结构以a-(1-3)连接的甘露糖为主链。1.1.5酸性低聚糖徐继英等(2006)在进一步证明子实体中酸性杂多糖AC和BC结构的过程中,用酸性水解的方法从中分离出3种均质的酸性低聚糖(H-1、H-2和H-3)。2、银耳多糖的提取及制备银耳中含有丰富的银耳多糖,其组分主要存在于小纤维网状结构交织的基质中,利用多糖溶于水而难溶于高浓度醇、醚、氯仿等有机溶剂的特点,采用热水浸提、碱浸提法、酶法提取、辅以超声波或微波处理,对多糖进行提取;然后经Sevag法除蛋白、双氧水或活性炭脱色、乙醇沉析分离,再经透析法、超滤法或层析法纯化,最后经干燥、粉碎,得多糖成品[4]。产品的产量、品质和复水性能与银耳的来源、溶剂、提取方法及纯化技术有关。而其中提取方法和浓缩干燥技术是其中最活跃的因素。2.1银耳多糖的提取方法2.1.1浸提法银耳多糖的浸提方法有水浸提、乙醇浸提、酶解、酸水解、碱法水解等[8]。2.1.1.1热水浸提法用水作溶剂来提取银耳多糖是最常用的方法之一,水提取的银耳多糖多数是中性多糖。热水提取法的步骤是[5]:优质选朵银耳-去离子水浸泡-去根一剪碎-加料-调节pH-加热提取-冷却静置-取上清液抽滤。但水的极性大,容易把蛋白质、苷类等溶于水的成分浸提出来,为后续的分离带来困难,且提取效率低和费时;同时热水浸提主要是提取胞外多糖,因而多糖得率较低。2.1.1.2碱浸提法银耳中的多糖主要有中性多糖和酸性多糖。银耳中的一部分酸性多糖在中性条件下不能继续溶出,因此在一定碱性条件下提取银耳多糖,会提高提取得率。虽然碱处理使多糖含量增加,但碱浸提法容易使部分多糖发生水解,破坏多糖的活性结构。2.1.1.3酶解提取法采用复合酶提取的方法提取银耳多糖,具有条件温和、杂质易除和得率高的优点。复合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。仅采用热水浸提,主要是提取胞外多糖,因而得率较低。采用酶法浸提:6],可以提取胞外多糖和胞壁多糖,因而得率较高。酶解提取法分两个阶段[7]:第一阶段主要作用是酶解细胞表面结构及胞间连接物,并伴有少量多糖溶出;第二阶段通过提高温度后,既具有灭酶作用,同时使可溶于热水的胞内多糖溶出率增加。2.1.2超声波辅助提取法超声波在液体内传播时,液体介质不断受到压缩和拉伸,在拉力作用下,液体断裂形成暂时的近似真空的空洞,压缩时,这些空洞就会发生崩溃,出现局部高温以及放电现象,产生空化作用。超声波空化可以从稳态空化转化成瞬态空化,空化泡瞬间长大破裂,吸收的能量在极短的时间和极小的空间内释放出来,形成高温高压的环境,同时伴随有一定强度的冲击波和微声流,从而破坏细胞壁结构,使其在瞬间破裂,释放细胞内的有效成分,大大提高了提取率。与传统萃取相比,超声萃取可以从不溶于乙醇的植物残基中获得更多的水溶性多糖㈤。超声可能会导致可溶性多糖发生降解,并溶解在乙醇溶液中,这些是超声的不足之处。然而,超声并不影响水溶性多糖的生物性能。因此,超声辅助提取法是一种高效实用的多糖提取方法。靳胜英[7]等(1995)在研究超声波辅助提取银耳多糖实验中,先采用湿法机械粉碎,再结合超声波破壁,最后热水温浸的方法来提取银耳中的多糖物质,3结果表明,复水完全的银耳子实体经机械粉碎、超声波处理后热水浸提的提取方法,能显著提高银耳多糖的浸提率,缩短浸提时间,浸提率比酶法浸提得率的16.3%高出4.693%。2.1.3微波辅助提取法微波提取过程中,微波辐射导致植物细胞内的极性物质尤其是水分子,产生大量热量,使得细胞内的温度迅速上升,液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞,进一步加热,导致细胞内部和细胞壁水分减小,细胞收缩,表面出现裂纹。由于孔洞和裂纹的存在,胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放胞内多糖[9]。微波的频率很高,能深入渗透物体,对细胞的结构有较大作用。微波加热的热效率高,温度升高快速而均匀,因此,应用微波加热提取手段,能够显著缩短萃取时间,较大程度地提高多糖的萃取效率。吴琼等[12]的研究结果证明微波提取较传统提取法提取率高,并且缩短了提取时间。微波提取银耳多糖的最佳条件是微波功率644.5W、温度99.1°C、保持时间24.0min。2.1.4超临界流体萃取法在超临界状态下,超临界流体与目标物接触,使其依次把极性、沸点和分子量大小不同的成分萃取出来,当恢复到常压和常温时,溶解在流体中的成分立即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开,从而达到萃取目的。另外,超临界流体的密度和介电常数随着密闭体系的压力增加而增加,极性增大,利用程序升压,可以将不同极性的成分进行分步提取。超临界CO2萃取法是采用CO2作为流体的一种超临界萃取方法。超临界CO2萃取与传统的溶剂萃取工艺相比,多糖类成分的收率可以提高到原来的1.62倍。超临界CO2萃取技术萃取能力强,提取效率高,生产周期短,容易发现新的活性成分,极少损失易挥发组分或破坏生理活性物质,没有溶剂残留,产品质量高。2.2银耳多糖的干燥方法银耳多糖由于本身高极性、难挥发、热不稳定的性质,不适用加热干燥方法制备。现行银耳多糖干燥工艺为将纯化后的多糖提取液用无水乙醇进行沉淀处理,然后通过高速离心脱水得多糖沉淀物,最后经冷冻干燥得多糖干粉。冻干产物质地疏松,多孔柔软,基本上没有硬质的干凝胶物,色泽比加热干燥的更好一些。2.3银耳多糖生理活性试验2.3.1银耳多糖清除羟自由基活性2.3.2银耳多糖清除超氧阴离子自由基活性2.3.3银耳多糖的抗氧化作用银耳多糖对油脂的抗氧化性能研究采用强制实验法,即将VC、VE、银耳多糖加入新炼制的猪油中,置于65°C的恒温烘箱中,定时取样检测猪油的过氧化值(POV值)。以POV值来表示油脂的氧化速度,进而衡量抗氧化剂的活性[10]。3、银耳多糖的功能特性3.1在食品生产中的加工特性银耳多糖中含有较多的均一性多糖(约占总多糖的70%〜75%),这类多糖具有增加溶液黏度及乳化稳定作用。可以用作食品强化剂、抗凝剂、乳化剂、增稠剂等。因此应用于饮料、乳制品及冷饮食品等加工中,不但能赋予食品良好的加工特性,同时亦能减少合成类添加剂的使用,提高食品的营养价值。如利用银耳多糖良好复水性开发的方便银耳红枣羹,利用银耳多糖增稠性和乳化性开发的银耳酸奶及银耳果冻等产品。3.2在化妆品生产中的加工特性银耳多糖具有一定的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力,可作为抗衰老成分应用到化妆品中。颜军等[10]通过测定银耳多糖对猪油的抗氧化性能表明银耳多糖的抗氧化作用明显。脂褐质是一种含脂和蛋白质的色素,呈黄褐色,存在老化细胞内,导致细胞代谢减缓,从而造成人体器官功能衰退产生衰老。陈依军等[11]通过对受试果蝇喂食银耳孢子多糖40天后,果蝇体内脂褐质含量有所降低。皮肤是人体最大的组织器官,脂褐质沉积在皮肤细胞会造成皮肤粗糙、黯淡、无光泽,将银耳多糖添加入护肤品中,具有一定的护肤养颜的作用。市场上以银耳多糖为原料的化妆美容品主要4类,分别是补水面膜、滋养面膏、美容口服液和减肥胶囊。任清等[9]通过体内测水合率和水分散失率法以及体外测水分散失率法证明银耳多糖具有较好的保湿能力和一定的抗氧化能力,可用于化妆品中。3.3银耳多糖的药理学特,性银耳多糖组成成分具有多样性,不仅单体多样,形成多聚体后的构型和构象同样多样;多种多糖混合一起,使其生物活性也多样。现代研究充分证实了银耳多糖具有多种药理学功能,其归纳如下:3.3.1免疫调节作用银耳多糖具有广泛的药理学作用。调节机体免疫功能是许多多糖的主要药理学作用之一,是多糖的共性。“银耳孢糖胶囊”和“银耳孢糖肠溶胶囊”,是以银耳多糖为主要原料生产的,具有升高白细胞、抗放射损伤和改善机体免疫功能作用,可用于放疗、化疗或其它原因引起的白细胞减少症,亦可作为放射损伤的辅助治疗。3.3.2抗肿瘤作用多年来,科学家们发现银耳多糖参与了细胞的各种生命现象的调节,如免疫细胞间信息的传递和感受、激活免疫细胞和提高机体的免疫功能等。通过这种参与,银耳多糖不仅可以借助增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用,还能通过直接作用于肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡等途径直接杀伤肿瘤细胞。徐文清等[11]研究发现银耳孢子多糖可促使肝癌小鼠的肝、脾、胸腺等器官有一定程度的增长。因为脾、胸腺为免疫器官,因此可见,银耳孢子多糖可促进小鼠免疫功能的增强。3.3.3降血糖、降血脂作用有研究表明,银耳多糖能够调节糖代谢酶的活性,促进胰岛分泌胰岛素抑制糖异生,促进外周组织对葡萄糖的利用[13],从而达到降血糖的作用。银耳多糖可以通过束缚和吸附血液中脂类促进胆固醇排出,阻断其在肝肠循环[14],达到降低血脂的效应。3.3.4抗溃疡作用银耳多糖可明显抑制大鼠应激型胃溃疡的形成,促进醋酸型胃溃疡的愈合,对胃酸分泌和胃蛋白酶活性并无影响[15]。利用银耳多糖治疗十二指肠溃疡124例疗效观察,近期有效率达98.6%,近期愈合率达79.03%。燕山大学课程设计说明书第二部分课程设计部分银耳多糖的提取与纯化工艺的设计银耳多糖是银耳中重要的活性成分,且其含量能占到银耳干重的百分之六十以上,具有重要的营养和要用价值,银耳多糖[6具有提高机体免疫力、抗衰老、清除体内自由基的作用。本设计通过微博辅助法提取银耳多糖,针对三个提取条件分别设计单因素实验,根据单因素实验得出最佳范围,然后再根据所得出的范围做三因素三水平的正交实验,从而得出最佳的提取条件组合。材料银耳:福建通江县产,干燥,粉碎后过40目筛,滤布100目。苯酚-硫酸标准品:购自中国药品生物制品检定所。实验所用的试剂均为分析纯。实验仪器MARS-5微波反应系统,美国培安公司;ZK-82A型真空干燥箱,上海市实验仪器总厂;HH-4型数显恒温水浴锅国,华电器有限公司;精密电子天平,上海第三分析仪器厂;UV2100型紫外可见分光光度计,上海第三分析仪器厂。方法3.1银耳多糖的微波提取称取银耳干粉2g,加60mL水浸泡2^放入微波提取器中,在100°C下微波加热15min,微波功率600W。将微波提取后的样品倒入烧杯中,继续加入100ml水(固液比1:80),在80C水浴中振荡提取2h。3.2银耳多糖的纯化3.2.1DEAE-SepharoseFastFlow柱层析分离将银耳多糖配制成10mg/ml溶液,微孔过滤后上样,上样体积为20ml,分布收集,将有活性多糖的峰收集后浓缩、冷冻干燥。洗脱条件为:300ml蒸馏水与3mol/L的NaCl250ml混合梯度洗脱,流速90ml/h,柱大小为2.6cmx30cm。3.2.2SephadexG-200凝胶过滤柱层析分离将3.2.1中的冻干样品复溶后配制成1mg/ml溶液,微孔过滤后上样,上样体积为10ml,分布收集,合并糖峰洗脱液,浓缩后冻干。洗脱条件为:蒸馏水洗脱,流速30ml/h,柱大小为2cmx80cm。3.3杂质检测若银耳多糖溶液在260nm和280nm处无明显吸收蜂[16,表明银耳多糖中不含核酸和蛋白质等杂质成分。3.4银耳多糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定银耳提取液中多糖质量浓度,即1ml银耳提取液中含多糖的质量,mg/mL。葡萄糖贮备液的配制:准确称取无水葡萄糖100mg,于100ml容量瓶中用去离子水定容,摇匀,备用。测定方法:准确吸取1mg/ml葡萄糖贮备液1.0ml,2.0ml,3.0ml,4.0ml和5.0ml置于50ml容量瓶,用去离子水定容,摇匀;准确吸取该系列溶液各2.0ml(以去离子水作空白对照),分别置于15ml具塞刻度试管中,加口1.0ml质量分数为5%的苯酚溶液,振荡混合均匀,加入5.0ml浓硫酸,混匀,5min后,封管沸水浴1h进行反应。反应结束后取出冷却至室温,在490nm处测吸光度值,绘制标准曲线,依据标准曲线确定提取液中多糖质量浓度。设计4.1银耳多糖提取条件的单因素实验4.1.1微波功率对银耳多糖提取率的影响在100°C下微波加热15min,根据本微波反应系统所能达到的功率,确定功率范围。在200-1200W的范围内,分别以200W、400W、600W、800W、1000W、1200W的功率来提取银耳多糖,比较多糖得率,得出最佳功率值。4.1.2加热时间对银耳多糖提取率的影响在100C微波功率为600W,考虑到如果微波加热时间过长实际意义不大,所以选择微波加热时间从5min到30min,分别以5min、10min、15min、20min、25min、30min作为加热时间,考察加热时间的变化对银耳多糖的提取率的影响。4.1.3加热温度对银耳多糖提取率的影响微波功率600W,微波加热时20min,加热温度从50-100°C,分别以50°C,60C,70C,80C,90C,100C为加热温度,考察不同加热温度对银耳多糖提取率的影响。4.2银耳多糖提取条件的正交实验根据单因素实验的结果缩小每个提取条件的范围,再根据缩小后的范围进行三因素三水平的正交实验。选取微波功率(A1W、A2W、A3W)、加热温度(B1C、B2C、B3C)、加热时间(C1min、C2min、C3min)做三因素三水平的正交实验(见表1)。表1银耳多糖提取正交试验编号A(微波功率/W)B(加热温度/C)C(加热时间/min)1A1B1C12A1B2C23A1B3C34A2B1C25A2B2C36A2B3C17A3B1C38A3B2C19A3B3C2通过正交试验结果分析可得影响银耳多糖提取效果各因素的主次顺序,从而得出最优试验组合。分析与总结银耳多糖是银耳中重要的活性成分,具有很高的营养价值,本设计通过采10用微波辅助提取法来提取银耳多糖。在微波提取系统中,影响多糖提取率的主要因素有三个:微波功率、加热时间、加热温度。针对这三个因素分别设计单因素实验,根据单因素实验得出最佳范围,然后再根据所得出的范围做三因素三水平的正交实验,从而得出最佳的提取条件组合。实验过程中应该注意的是,在微波功率的设置中,功率过大可能会造成多糖的分解从而使得率降低;加热时间和加热温度的适当选取,可使银耳细胞内的水分充分气化,使细胞破壁,从而大大提高多糖提取率。微波提取较传统提取法提取率高,并且缩短了提取时间。本实验采用破壁与浸取联合工艺。可以采取先用微波处理经浸润后的十银耳子实体,然后再加水浸取有效成分的工艺,这样既可以节省能源,又可以连续工业化生产。通过这次的课程设计,一方面我对银耳多糖有了更加深入的了解,另一方面我对优化思想有了初步的了解并且亲身经历了这一优化设计的过程,并在这个过程中完成了查阅资料、提出设计思路、撰写说明的系统结合。在这次课程设计过程中我学到了很多知识,拓宽了视野,对以前一些一知半解的知识有了更清晰的诠释,对office操作技术更加熟练。虽然这只是一次短暂的设计经历,也不会引发怎样的技术革命,但这却是人类千万次试验探索中的一次,只有积累这每一次的小探索,才能真正挖掘科学的力量。因此,我应该更加不懈地努力,珍惜每一次亲身设计实践的机会。参考文献来吉祥,何聪芬,等.银耳多糖工业化提取

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