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文档简介

DNA芯片DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸探针,或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物,所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片(genechips)、DNA阵列(DNAarray)、cDNA芯片(cDNAchips)、寡核苷酸阵列(oligonucleotidearray)等。DNA芯片技术DNA芯片原理及分类DNA芯片的操作DNA芯片技术的应用与展望DNA芯片的基本原理

基因芯片的原理是基于核酸分子碱基之间(A-T/C-G互补配对的原理,利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术将基因或DNA分子排列在特定固体物表面构成的微点阵。然后将标记的样品分子与微点阵上的DNA杂交,以实现多达数万个分子之间的杂交反应,高通量大规模地分析检测样品中多个基因地表达状况或者特定基因(DNA)分子的是否存在的目的

基因芯片的优点:高通量·大规模·高度平行性·快速高效·高灵敏度·高度自动化缺点:在同一温度下杂交,不同探针杂交效率不同。DNA芯片制备原理

原理--通过杂交检测信息一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTADNA芯片DNA芯片分类根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类:原位合成芯片

syntheticgenechips:指采用显微光蚀刻技术在芯片的特定部位合成寡核苷酸而制成的芯片。

特点:合成的寡核苷酸链较短,密度较高。DNA微集阵列

DNAmicroarry:指将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面。特点:片段较长,密度较低。DNA芯片DNA芯片的操作及应用DNA芯片基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析DNA芯片基因芯片荧光标记的样品共聚焦显微镜获取荧光图象杂交结果分析探针设计杂交DNA芯片DNA芯片的制备芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备DNA微集陈列的制备DNA芯片基因芯片结构示意图DNA芯片的制备支持物分两类实性材料包括硅芯片,玻璃,瓷片等。目前最常用者为玻璃。预处理的目的是使其表面形成羟基,氨基等活性基团,以便与单核苷酸或DNA形成共价键膜性材料包括聚丙烯膜,尼龙膜,硝酸纤维素膜等通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等,使其带上正电荷,以吸附DNA支持物的预处理:DNA芯片DNA芯片的制备原位合成芯片的制备1显微光蚀刻技术优点:合成速度快,步骤少缺点:合成的探针短,效率低2压电打印法合成的探针可达40-50nt,合成效率较高DNA芯片DNA微阵列的制备采用事先合成的DNA或制备基因探针,然后打印在支持物上喷墨打印优点:速度快,量准,对支持物表面要求低;缺点:斑点大,探针密度低,液滴分配不均针式打印优点:简便,价低,液滴小,探针密度大;缺点:准确性和重现性差DNA芯片的制备DNA芯片喷墨打印技术DNA芯片针式打印法(接触式点样)Best!DNA芯片点阵的制作DNA芯片

样品的准备

样品的准备包括样品的分离纯化扩增标记DNA芯片分离纯化:样品来源于活的细胞,使用一定方法分离并纯化DNA或RNA(特别是mRNA)。只有达到一定纯度的样品,才能保证后续操作的正确。目前分离纯化使用的试剂均有商品出售,品牌繁多,原理也不尽相同,产物收率和耗时也相差甚远分离纯化DNA芯片样品准备样品准备样品的扩增:扩增的目的在于获得足够的样品量。现已发展出固相PCR系统。样品的标记:主要采用荧光标记法,也可用生物素,或放射性核标记。标记的方式采用PCR或RT-PCR。常用的荧光色素为Cy3、Cy5。用Cy3、Cy5标记dNTP,经PCR后,产物即可被标记。待测样品和对照可采用双色荧光标记。样品扩增和标记DNA芯片

分子杂交

芯片的杂交:将已知序列的DNA探针显微固化于支持物表面,将已标记好的样品与之进行杂交,杂交过程一般在30分钟完成。样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别:杂交时间短,30分钟内完成可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素:盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构DNA芯片

检测分析

原理:待测样品与支持物上探针列阵杂交后,荧光标记的样品结合在芯片的特定位置,未结合的探针被除去;样品与探针严格配对的杂交分子,热力学稳定性高,产生的荧光信号强,不完全配对的,荧光信号弱;不能杂交不产生荧光信号分析:采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信号(位置、强度、颜色),并与对照比较,经相关软件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。经以上获得的数据十分庞大,还需进行分析,比较,归纳,才能得出明晰的结论。DNA芯片DNA芯片基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫DNA芯片DNA芯片技术的应用

231疾病的诊断与治疗,

杂交测序基因表达分析DNA芯片

基因表达分析

人类基因组编码大约30,000个不同的基因,仅掌握基因序列信息资料,要理解其基因功能是远远不够的。因此,具有监测大量mRNA的实验工具很重要。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的mRNA,且易于同时监测成千上万的基因。

DNA芯片

杂交测序

芯片技术中杂交测序(sequencingbyhybridization,SBH)技术是一种新的高效快速测序方法。用含65,536个8聚寡核苷酸的微阵列,采用SBH技术,可测定200bp长DNA序列。采用67,108,864个13聚寡核苷酸的微阵列,可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高,但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性,降低了杂交准确性。DNA芯片

疾病的诊断与治疗基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比:它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测;无需机体免疫应答反应,能及早诊断,待测样品用量小;能检测病原微生物的耐药性,病原微生物的亚型;极高的灵敏度和可靠性;检测成本低,自动化程度高,利于大规模推广应用。这些特点使得医务人员在短时间内,可以掌握大量的疾病诊断信息,这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。

DNA芯片DNA芯片展望DNA芯片的出现和应用,为DNA测序,诊断,大面积人群的筛查带来了极大的方便,具有通量高,快速,等优点。但其不足之处亦是显而易见的:稳定性较低;只能探查已知基因;费用过高及临床使用的非必须性等因素成为其发展受到影响。

尽管基因芯片技术在生命科学领域越来越受到广泛的关注和重视,但在其研究与开发中目前还面临很多困难,如技术成本高,生产和使用还过于复杂,检测灵敏度还不尽人意、重复性差、分析范围狭窄等.这些问题主要集中在样品的制备、探针的合成和固定、分子的标记、数据的读取和分析等几个方面,但这些问题终将会得到很好的解决.可以预见,随着功能基因组学研究的深入及芯片技术的不断完善,这一新的技术革命必将在生命科学和相关领域发挥巨大的作用.《化妆品术语》起草情况汇报中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所一、标准的立项和下达时间2006年卫生部政法司要求各标委会都要建立自己的术语标准。1ONE二、标准经费标准研制经费:3.8万三、标准的立项意义术语标准有利于行业间技术交流、提高标准一致性、消除贸易误差,作为标准体系中的基础标准,术语标准在各个领域的标准体系中均起着重要的作用。随着我国化妆品卫生标准体系建设逐步加快,所涉及的术语和定义的数量也在迅速增长,在此情形下,化妆品术语标准的制定就显得尤为重要。四、标准的制订原则1.合法性遵守《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监督条例实施细则》中关于化妆品的定义。2.协调性直接引用或修改采用的方式,与相关标准中的术语和定义相协调。3.科学性对于没有国标或定义不统一的术语,在定义时体现科学性的原则。4.实用性在标准体系中出现频率较高,与行业联系较紧密的术语优先选用。五、标准的起草经过

第一阶段:资料搜集

搜集国内外相关法规、标准、文献并对国外文献如美国21CFR进行翻译。第二阶段:2007年末形成初稿

初稿内容包括一般术语、卫生化学术语、毒理学术语、微生物术语、产品术语、人体安全和功效评价术语,常用英文成份术语等7部分。第三阶段:专家统稿1.2007年12月第一次专家统稿会(修订情况:1.在结构上增加原料功能术语、相关国际组织和科研机构等内容;2.在内容上增加一般术语、产品术语的种类,将化妆品行业的新产品类别纳入本标准;3.对于毒理学、卫生化学、微生物学术语进行修改;4.删除与化妆品联系不紧密、无存在必要的常用英文成分术语。2.2009年1月第二次专家统稿会会议意见:1.修改能引用国家标准的尽量引用国家标准;对存在歧义的个别用词进行修改。2.删除由于本标准中的“产品术语”一章和香化协会所制定的某个标准存在重复,因此删除“产品术语”一章的内容;对“原料功能术语”的内容进行梳理,删除了20余条内容。3.增加专家建议增加“化妆品限用物质”等若干项术语。第四阶段:征求意见2009年2月面向全国公开征求意见。第五阶段:征求意见的处理与形成送审稿。在征求意见的处理阶段再次征求了相关专家的意见。六、标准的内容依据1.《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监督条例实施细则》;2.《化妆品卫生规范》;3.美国21CFR;4.相关领域国家标准如:GB5296.3-2008消费品使用说明化妆品通用标签,GB/T14666-2003分析化学术语等;5.国内外化妆品的相关文献,如《化妆品监督管理及安全性评价》等。七、标准的结构和主要内容(一)结构:1.范围2.一般术语3.毒理学试验方法术语4.卫生化学检验方法术语5.微生物检验方法术语6.人体安全性和功效性评价术语7.常用原料术语8.缩写9.中英文索引(二)主要内容:1).一般术语39条涉及化妆品的基本定义、化妆品生产和监督管理中出现频率较高的术语。2).毒理学试验方法术语40条收录了《化妆品卫生规范》中涉及的术语,以及在毒理学领域出现频率较高、与化妆品毒理学试验方法联系较密切的术语。3).卫生化学检验方法术语22条收录了化妆品的卫生化学检验方法中较常用的术语。

4).微生物检验方法术语6条收录了《化妆品卫生规范》中所涉及的术语。5).人体安全性和功效性评价术语38条收录了人体安全性和功效性评价的常用术语。6).常用原料术语55条收录了常用原料术语,与《化妆品管理及安全性和功效性评价》保持一致,并根据企业、专家的意见进行了适当修改。7).缩写涉及国际机构缩写以及化妆品毒理学、化学、人体安全性和功效评价等领域专业术语的缩写34条。七、征求意见处理情况2009年2月20日,《化妆品术语》在全国公开范围内公开征求意见,截止到2009年3月末共收到来自企业、和社会各界的意见和建议共146条,分布情况如下:征求意见来源统计图二一般术语

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