DB50T 1407-2023 新城疫病毒免疫层析（胶体金）检测技术规范

ICS65.020CCSB41DB50重 庆 市 地 方 标 准DB50/T1407—2023新城疫病毒免疫层析（胶体金）检测技术规范2023-05-25发布 2023-08-25实施重庆市市场监督管理局 发布DB50/T1407DB50/T1407—2023前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由重庆市农业农村委员会提出、归口并组织实施。本文件起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心、重庆理工大学。I新城疫病毒免疫层析（胶体金）检测技术规范范围（胶体金本文件适用于检测泄殖腔拭子、咽拭子、组织样品、鸡胚尿囊液及细胞培养液中的新城疫病毒。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T39707 医疗废物处理处置污染控制标准SN/T2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。检测原理（NC膜（多克隆抗体捕（T线TBalb/C小鼠免疫球蛋白抗体结合，形成第二条结合线（质控线，简称C线），若C线不显示红色，则检测结果无效。胶体金试纸卡结构如图1所示：图1 胶体金试纸卡结构示意图1设备与耗材（1000.3μm颗粒过滤效率≥99.999（最22000℃～＋40（0.001、玻璃匀浆器（5mL）、移液器、棉拭子、塑料滴管、离心管。材料胶体金试纸卡可制备或采用商品化产品。试纸卡制备方法见附录A。应室温或冷藏保存。样品稀释液可配制或采用商品化的PBS试剂（pH7.2）。配制按如下配方：氯化钠（NaCl）8g、氯化钾（KCl）0.2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、（KH2PO4）0.241000pH至7.2，分装，121℃、15min高压灭菌。样品前处理一般要求样品前处理应符合SN/T2984的规定。泄殖腔和咽拭子0.8mL～1.0mL2℃～8℃，12,000r/min10min，取上清液待检。样品24小时的，应冷冻保存。组织样品称取组织块0.5g，置于匀浆器中，加pH7.2PBS试剂1mL，研磨完全后取出组织匀浆液，置2℃～8℃，12,000r/min离心10min，取上清液待检。鸡胚尿囊液尿囊液样品置2℃～8℃，12,000r/min离心2min，取上清液待检。细胞培养液反复冻融32℃～8℃，12,000r/min2min，取上清液待检。样品检测2～3滴（100μL～150μL）。25min～10min，观察结果。结果判定阳性当试纸卡出现两条紫红色条带（TC线），结果判为阳性，记为“＋”。阴性当试纸卡仅出现一条紫红色条带（C线），结果判为阴性，记为“－”。无效C线，不论是否出现T线，结果均判为无效。废弃物处理GB/T39707的规定。3附 录 A（资料性）新城疫病毒胶体金试纸卡的制备单克隆抗体制备利用杂交瘤技术，通过细胞融合，筛选制成特异性新城疫病毒（NDV）单克隆抗体。该抗体针对NDV血凝素，决定了试纸卡的特异性。多克隆抗体制备羊抗NDV抗体 用纯化的NDV免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗NDV抗体该抗体可与金标抗体——NDV抗原抗体复合物结合形成夹心抗原抗体复合物用于胶体金试纸卡硝酸纤维膜（NC膜）的捕获线。羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫山羊后，提Balb/C（NC膜的质控线，可与金标抗体结合，以此检验试纸卡的有效性。金标抗体制备30nm胶体金颗粒，将NDV18μg/mL进行标记，1BSA胶体金结合垫制备将玻璃纤维膜浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween‑20，0.3％BSA的处理410～124～5h50mm宽度，即制成胶体金结合垫。胶体金样品垫制备样品垫浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween‑20，0.3％BSA的处理液中，在37℃的温度下干燥2h后，切成40mm宽度，用于过滤样品中的有形成分，同时保证NDV抗原不变性。样品垫置于试纸卡的最前端，样品孔的下端。试剂条板制备（NC膜NC膜喷样NC（