酶工程知识要点

1、 酶的定义与分类定义：酶是具有生物催化功能的生物大分子。分类：蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）2、 生物催化剂的特点①易失活（温和性）：酶是由细胞产生的生物大分子，凡能使生物大分子变性的因素，如高温、强碱、强酸、重金属盐等都能使酶失去催化活性。②高效性：反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的106——1016倍。且无副反应③专一性：酶对催化的反应和反应物（底物）有严格的选择性，只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质，而一般催化剂没有这样严格的选择性。绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应，甚至只能作用于异构体的一种（立体异构专一性）相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应。④可调节性：（1）酶浓度的可调性（诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解）（2）通过激素调节酶活性（与细胞膜或细胞内受体相结合）（3）反馈抑制调节酶活性（如终端产物抑制）（4）抑制剂和激活剂对酶活性影响（5）别构调控、酶原的激活、共价修饰、同工酶等3、 米氏常数Km的意义Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。意义：①Km是酶的特性常数：与pH、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。②可以判断酶的专一性和天然底物。1/Km近似表示酶对底物的亲和力：1/Km越大、亲和力越大 Km较小者为主要底物③根据Km：判断某［s］时v与Vmax的关系判断抑制剂的类型④Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径催化可逆反应的酶对正/逆两向底物Km不同4、 可逆抑制作用分类、特点（书）P8（1）.不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。分为非专一性不可逆抑制剂，和专一性不可逆抑制剂。很多为剧毒物质，如重金属、有机磷、有机汞、有机砷、氰化物、青霉素、毒鼠强等。（2）、可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活。①竞争性抑制：表观Km增大Vmax不变；②非竞争性抑制：表观Km不变Vmax减小；③反竞争性抑制：表观Km减小Vmax减小；5、 蛋白类酶（P酶）的分类与命名（命名：课件）第1类，氧化还原酶。其催化反应通式为：AH2+B=A+BH2系统命名：“氢供体:氢受体氧化还原酶”被氧化的底物（AH2）为氢或电子供体，被还原的底物（B）为氢或电子受体。第2类，转移酶；其反应通式为：AB+C=A+BC系统命名：“供体：受体某基团转移酶”L-丙氨酸+2-酮戊二酸=丙酮酸+L-谷氨酸第3类，水解酶；其反应通式为：AB+H2O=AOH+BH。系统命名：“底物发生水解作用的化学键位置水解酶”第4类，裂合酶；其反应通式为：AB=A+B一般裂合酶在裂解反应方向只有一个底物，而在缩合反应方向却有两个底物。催化底物裂解为产物后，产生一个双键。系统命名：“底物-裂解的基团-裂合酶”。第5类，异构酶；其反应通式为：A=B。系统命名：异构酶按照异构化的类型不同，分为6个亚类。命名时分别在底物名称的后面加上异构酶、消旋酶、变位酶、表异构酶、顺反异构酶等。第6大类，合成酶（或称连接酶）。系统命名：“两个底物的名称连接酶。其反应通式为：A+B+ATP=AB+ADP+Pi（或A+B+ATP=AB+AMP+PPi）6、 酶活力测定方法:快速简便准确①据酶催化的专一性选择适宜底物.②据酶动力学性质确定温度,pH值，底物浓度，激活剂浓度等•③酶与底物混合均匀,记下反应时间.④终止反应：测定产物生成量或底物减少量7、 酶活力单位如何定义、相对酶活力定义常用的酶活力单位有三种：A.国际单位（IU）:在标准条件（25r、最适pH、最适底物浓度）下，酶每分钟催化Immol底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位（IU）。B.Katal:在最适条件下，酶每秒钟催化1mol底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个Kat。C.自定义的活力单位：习惯上将测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单位。8、 酶的比活力酶的比活力（纯度）=酶活力/蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）（比活力越高，酶纯度也越好。表示酶制剂纯度的一个指标。）纯化倍数二提纯后比活力/提纯前比活力（表示提纯过程中纯度提高的倍数。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。）总活力=酶活力单位数x酶液总体积回收率=提纯后酶总活力/提纯前酶总活力X100%。（表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。）提纯倍数：表示方法的有效程度。（一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。）9、 酶生产的各种方法及优缺点①提取分离法：采用各种提取分离技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。优点：设备较简单，操作较方便。缺点：受生物资源，地理环境，气候条件等影响②生物合成法：利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。优点：生产周期短，酶的产率高，不受生物资源、地理环境和气候条件等影响。缺点：对发酵设备，工艺条件要求较高。③化学合成法：模拟酶一分子水平上模拟酶活性中心的结构特征和催化作用机制，设计并合成的仿酶体系。优点：酶的人工模拟和化学修饰，对认识和阐明生物体的行为和规律，设计和合成具有酶的催化特点又克服酶的弱点的高效非酶催化剂缺点：成本高，酶的化学结构已知。10、 酶合成的调节机制（）（1）转录水平的调节（2）转录产物的加工调节（3）翻译水平的调节（4）翻译产物的加工调节（5）酶降解的调节原核生物合成调节主要是转录水平的调节，分为以下三点：①酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。已知分解利用乳糖的酶有：。-半乳糖苷酶；阡半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。②末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。③分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”11、 酶生物合成的模式（论述、图文结合）比较酶产生与细胞生长的关系，可把酶生物合成模式分成4种类型：（1）同步合成型：酶的合成与细胞的生长同步进行。特点：（1）酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；（2）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止；（3）酶所对应的mRNA很不稳定。（2） 延续合成型：酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期后，酶又延续合成一段时间。特点：（1）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；（2）酶所对应的mRNA相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长时间用于酶的合成。（3） 中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期后，酶的合成随之停止。特点：（1）酶的合成受到反馈阻遏；（2）所对应的mRNA不稳定。（4） 滞后合成型：当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶。特点：（1）在对数生长期不合成酶（可能是受到分解代谢物阻遏的影响）；（2）所对应的mRNA稳定性高。c1)-5〉［¥M 1(in>(IVJ///■£ x 一*. 时间th>二，二供WSS恭12、 影响酶生物合成的模式的主要因素是：（1）mRNA的稳定性；（2）培养基中阻遏物存在与否。规律：（1）mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其所对应的酶；（2）mRNA稳定性差的，酶的合成随着细胞停止生长而终止；（3）受某些物质阻遏的，需在细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶。（4）不受某些物质阻遏的，酶的合成随着细胞生长而同步增长。13、 选择最理想的酶合成模式——延续合成型14、 用于酶的生产的细胞必须具备的条件及各产酶微生物所产酶的类型。酶的产量高（这是最基本、最重要的要求）2.容易培养和管理（对培养基和工艺条件没有特别苛刻要求，易生长繁殖，适应性强，易于控制，便于管理。）3.产酶稳定性好（稳定产酶，不易退化）4.利于酶的分离纯化（最好分泌胞外酶，产量高且易纯化）5.安全可靠，无毒性（要求产酶细胞及其代谢产物安全无毒，不会对人体和环境产生不良影响，也不会对酶的应用产生其他不良影响15、 培养基的配置有哪些因素、选择原则所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。①碳源：提供能量；构成细胞，酶的重要组成元素。考虑分解代谢物阻遏作用及酶生物合成诱导作用。原料来源，价格，对发酵工艺条件及酶的分离纯化的影响等。②氮源：蛋白质及核酸等组分的重要元素之一；各种酶分子的组成元素。有机氮：（异养型细胞，动物细胞）无机氮：（自养型细胞，植物细胞）注意比例：铵盐与硝酸盐、碳元素与氮元素。③无机盐：组成元素，调节pH值、渗透压和氧化还原电位。④生长因素。细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。一般添加含有多种生长因素的天然原料的水解物：酵母膏，麦芽汁，麸皮水解液等。16、 溶解氧的调节控制方法1）调节通气量：增大通气量，提高溶氧速率。2）调节氧分压：提高氧分压，增加氧的溶解度，提高溶氧速率。3）调节气液接触时间：延长气液接触时间（增设档板），提高溶氧速率。4）调节气液接触面积：增加气液接触面积，提高溶氧速率。5）改变培养液性质等来实现：改变培养液组分或浓度，降低粘度；设消泡装置或消泡剂。17、提高酶产量的措施1.菌种选育（1）诱变育种①使诱导型变为组成型——选育组成型突变株②使阻遏型变为去阻遏型（2）基因工程育种2.条件控制：（1）添加诱导物（2）控制阻遏物浓度（3）添加表面活性剂（增加细胞膜通透性，利于胞外酶分泌；提高酶稳定性及催化能力。）（4）添加产酶促进剂：作用机制不清18、细胞生长动力学细胞生长速率与细胞浓度成正比：Rx=dX/dt=口X（u:比生长速率）莫诺德方程： 'dtXKs+S只存在一种限制性基质时:Ks（莫诺德常数）：比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。即呻0.5旦m时，S=Ks（S为限制性基质浓度，Pm为最大生长速率，当S>>Ks时，4旦m；当^=0.5Mm时，S=Ks）在稳态时，游离细胞连续发酵的生长动力学方程式为：Rx=dx/dt=（P-D）X D：稀释率D=0，分批发酵;D<u,细胞生长速率+，细胞浓度增加；D=u,细胞生长速率0，细胞浓度恒定;D>u,细胞生长速率-，细胞浓度下降,S升高,u回升；D>um,细胞浓度趋于零。19、 细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同宏观产酶动力学公式：dE/dt=（aM+P）xX一细胞浓度；u一细胞比生长速率；a一生长偶联的比产酶系数；p一非生长偶联的比产酶速率。细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同同步合成型：生长偶联型p=0，dE/dt=aMX中期合成型：特殊生长偶联型p=0，dE/dt=aMX；有阻遏存在时，a=0，无酶产生dE/dt=0，阻遏解除后才开始合成酶.滞后合成型：非生长偶联型a=0,dE/dt=pX延续合成型：部分生长偶联型，a尹0，p尹0 dE/dt=aMX+pX20、 固定化细胞产酶动力学固定化细胞连续产酶动力学公式：dX/dt=pgXg+（uf-D）XfD<uf,游离细胞浓度越来越高，直至平衡；SS''D>uf，游离细胞浓度越来越低，直达新的稳态;固定化细胞不受影响，故可在高稀释率下连续发酵;D=uf,细胞浓度达动态平衡.21、 固定化细胞发酵产酶的特点（1）提高产酶率：细胞密度增大---生化反应加速---产酶率提高。（2）可以反复使用或连续使用较长时间：不易脱落流失。（3）基因工程菌的质粒稳定，不易丢失。（4）发酵稳定性好：细胞受载体保护，pH和T适应性宽。（5）缩短发酵周期，提高设备利用率。（6）产品容易分离纯化。（7）适于胞外酶等胞外产物的生产。22、 固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制：与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：（一）固定化细胞的预培养：先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵产酶，其培养基和工艺条件可以相同或不同。（二）溶解氧的供给：由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。解决办法：（1）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；（2）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；（3）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的H2O2；（4）降低培养基的浓度，以降低培养基的粘度。（三）温度的控制：连续发酵时，由于稀释率较高，反应器内温度变化较大，先预调流加液温度。（四）培养基成份的控制：某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响，如过量的磷酸盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞。23、 固定化原生质体的特点1.变胞内产物为胞外产物；2.提高产酶率；3.稳定性较好；4.易于分离纯化。24、 固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制1.渗透压的控制；2.防止细胞壁的再生；3.保证原生质体的浓度。25、 植物细胞培养的特点1）提高产率：紫草细胞培养生产紫草宁，比产率（mg/d.g）提高830倍。2）缩短周期：生产周期一般15-30天。3）易于管理，减轻劳动强度：在人工控制条件的生物反应器中生产。4） 提高产品质量：主要产物产率高，杂质较少，减少有害物质污染，产物易于分离纯化。5） 其他:注意光照，对前切力敏感.26、 细胞破碎方法及其原理机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。方法有：捣碎法、研磨法、匀浆法。物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。方法有：温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法。化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。方法有：有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿;表面活性剂：Triton、Tween。酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。方法有：自溶法、外加酶制剂法27、 细胞破碎确认1.直接测定破碎前后的细胞数2.测定导电率。3.测定释放的蛋白质量或酶活力。28、 盐溶:大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。盐析：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。29、 影响酶提取的主要因素1温度：不影响酶活性条件下适当提高温度。2pH值：避开酶的等电点，不宜过高及过低。3提取液体积：过量提取液不利于分离纯化，为原料体积3-5倍。4其他：颗粒小，适当搅拌，适当延长提取时间等可以提高提取率。适当加入某些保护剂：底物、辅酶、抗氧化剂等。30、 沉淀分离方法（1） 盐析沉淀法：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离（2） 等电点沉淀法（沉淀不完全，常联合其他方法）利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离（3） 有机溶剂沉淀法：利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离（4） 复合沉淀法：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离（5） 选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离

31、酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02〜0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2〜6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8〜12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶［的分类与类别截留的颗粒大小主要物质过滤介质粗滤>2um酵母*3菌、动植物细胞、固形物滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷微滤0.2—2um细菌、灰尘微滤膜超滤20A—々0.2urn病毒、生物大分子超滤膜反渗透<20A生物小分子、盐、离子反渗透膜32、层析分离方法层析技术，亦称色谱技术,它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别（分子大小和形状、极性、吸附力、亲和力、分配系数），使各组分以不同比例分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离。分配层析：利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离。离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。凝胶层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离。亲和层析:利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化。层析聚焦:将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离33、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质-SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同，长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质一SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。34、 双水相萃取（ATPE）原理、优势总结萃取原理：聚合物的不相溶性：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。双水相的优势：（1）含水量高（70%--90%），在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；（2）可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；（3）分相时间短，自然分相时间一般为5min〜15min；（4）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；（5）大量杂质可与固体物质一同除去；（6）易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；（7）操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；（8）亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。35、 超临界流体（常用CO2）特性、原理特性：超临界流体物理特性和传质特性介于液体和气体之间：密度比气体大得多，具有和液体同样的溶解能力；扩散系数接近气体，黏度大大低于液体的。这种流体兼有气液两重性的特点，它既有与气体相当的高渗透能力和低的粘度，又兼有与液体相近的密度和对许多物质优良的溶解能力。原理：溶质在某溶剂中的溶解度与溶剂的密度呈正相关，SCF也与此类似。因此，通过改变压力和温度，改变SCF的密度，便能溶解许多不同类型的物质，达到选择性地提取各种类型化合物的目的。36、 反胶束萃取优点1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。37、 金属离子置换修饰定义把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。38、 金属离子置换修饰的过程酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。2.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。3.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。4.注意：金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。39、 金属离子置换修饰作用1.阐明金属离子对酶催化作用的影响。2.提高酶的催化效率：杂离子型的a-淀粉酶换成钙离子型，提高活力。3.增强酶的稳定性：Fe-SOD——Mn—SOD,提高稳定性。4.改变酶的动力学性质：最适pH,米氏常数等的改变。40、 大分子结合修饰过程、作用定义：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。（应用广）大分子修饰（共价）的过程：（1）修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。（聚乙二醇是线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。）（2）修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。（3）修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。（4）分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。41、 酶分子物理修饰：定义:通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的催化特性的方法。特点：在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。42、 酶修饰后的性质变化（1）热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。（2）抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。（3）各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。（4）半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。（5）最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。（6）Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。43、 氨基酸置换修饰定义、作用定义：将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。作用：1.提高酶的催化效率：酪氨酰-tRNA合成酶，催化效率提高25倍。2.增强酶的稳定性：T4溶菌酶，热稳定性提高。3.改变酶的专一性：枯草杆菌蛋白酶。修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。44、 固定化酶定义、优缺点定义：在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重复使用；固定化酶优缺点：优点（1）提高酶稳定性；（2）可反复或连续使用，酶的使用效率提高，成本降低；（3）易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺,增加产物收率，提高产物质量；（4）酶反应过程可严格控制；（5）较游离酶更适合多酶反应。缺点：（1）固定化时酶活有损失；（2）增加了生产初始成本；（3）只能用于可溶底物且较小分子；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶需分离。制备原则：（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；（3）应有最小的空间位阻；（4）酶与载体必须结合牢固；（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；（6）成本要低。45、 酶固定化的方法每种方法及优缺点酶的固定化:将酶固定在水不溶性载体上，制备成固定化酶的过程1.吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。特点：操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.2.包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法。多孔载体：琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等。①凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中。不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化;天然凝胶：条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差。合成凝胶：强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活②半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制定固定化酶。底物和产物都是小分子物质的酶结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键（非共价健）与酶结合在一起的固定化方法。活力损失少，结合力较弱，条件（pH值和离子强度）改变时，酶易脱落。①离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合。特点：活力损失少；结合力较弱，条件（pH值和离子强度）改变时，酶易脱落。②共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合。特点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间；操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构。双功能试剂:戊二醛、己二胺、双偶氮苯等。特点:结合牢固，可以长时间使用；因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便。5.热处理：在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内。热稳定性较好的酶的固定化，要严格控制加热及其时间46、 稳定性比游离酶的好，体现在：①对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度②保存稳定性好，保存时间延长③对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解④对变性剂（如尿素、有机溶剂、盐酸胍等）的耐受性提高，保留较高酶活⑤对酶抑制剂、对不同pH稳定性提高.47、 固定化酶的特性1、稳定性2、最适温度3、最适pH4、底物特异性48、 氨基酰化酶：世界上第一种工业化生产的固定化酶。葡萄糖异构酶：世界上生产规模最大的固定化酶。49、 固定化原生质体的特点：（1）解除了细胞壁这一扩散障碍，增加细胞膜通透性，利于氧气和营养物质的传递和吸收，也利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。（2）由于有载体的保护，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长时间，利于连续化生产。（3）易于和发酵产物分开，利于产品的分离纯化，提高产品质量。（4）需要添加渗透压稳定剂，保持其稳定性。50、 酶的非水相催化的定义及主要内容定义：酶在非水介质中进行的催化作用。主要内容：一、有机介质中的酶催化：适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。二、气相介质中的酶催化：适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。三、超临界介质中的酶催化：对酶结构、催化无影响。具有良好化学稳定性，对设备没腐蚀。临界温度不能太高。廉价宜得。四、离子液介质中的酶催化：酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点51、 有机介质反应体系种类、各自构成1.微水介质体系（非极性有机溶剂酶悬浮体系）:有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性。2.与水溶性有机溶剂组成的均一体系：水和极性较大的有机溶剂互相混容组成的反应体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。极性较大的有机溶剂对酶活性影响大，能用于该体系的酶少。辣根过氧化物酶催化酚类或芳香胺类聚合。3.与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相反应体系：水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系。游离酶、亲水性底物或产物溶于水相，疏水底物或产物溶于有机相。应用不广泛。4.正胶束体系：在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。酶在胶束外面（水相），疏水底物或产物在胶束内部，反应在两相界面。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。5.反胶束体系：在大量与水不相混容的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。酶分子在反胶束内部的水溶液，疏水性底物或产物在反胶束外部，反应在两相界面。52、 酶在有机介质中的催化特性有哪几点？（1）底物专一性。在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，使酶的底物特异性发生改变。（2）对映体选择性。是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体能力大小的指标。立体选择系数越大，对映体选择性越强。酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中较差。（3）区域选择性。酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。（4）键选择性。在同一底物分子中有2种以上的化学键都可以与酶反应，酶对其中一种化学键优先进行反应。（5）热稳定性。许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中更好；且随着介质中水含量的增加，热稳定性降低。（6）pH值特性。在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体之前所使用的缓冲液PH值相同，这种现象称为pH印记。53、 有机溶剂对酶催化有何影响。有机溶剂对酶结构与功能的影响：①对酶分子表面结构的影响。有机溶剂结合到酶分子上，改变酶分子结构。②对酶活性中心结合位点的影响。有机溶剂结合到活性中心，与底物竞争结合位点，降低底物结合能力。2.有机溶剂对酶活性的影响。极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。LgP：极性系数，表示有机溶剂极性强弱（P指溶剂在正辛烷与水两相分配系数）。极性系数越小，极性越强。LgP<2不适宜。3.有机溶剂对底物和产物分配的影响。有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。54、 有机介质中酶催化反应的条件及其控制反应类型：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应。主要应控制的条件：（一）酶的选择：1.酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌吟氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。2.酶形式的选择：①酶粉；②化学修饰酶；③固定化酶：（二）底物的选择和浓度控制：1.根据酶在有机介质中的底物专一性选择适宜底物；底物在有机溶剂和必需水层的分配情况.3.高浓度底物抑制作用（三）有机溶剂的选择：1、有机溶剂疏水性强：底物难于从有机溶剂进入必需水层，酶中心结合的底物浓度低，反应速度下降。2、有机溶剂极性强：夺取酶分子表面结合水，影响酶分子结构；疏水性底物溶解度低，底物浓度降低，反应速度下降。（四）水含量的控制：水含量低，反应速度随水含量升高而增大；达到最适水含量，反应速度最大；超过最适水含量，反应速度降低。最适水含量与溶剂极性有关；极性增大，最适水含量也增大。（五）温度控制：微水有机介质中，由于水含量低，酶的热稳定性增强，最适温度高于水溶液。（六）pH值控制：酶分子从缓冲液转到有机质时，pH状态不变（pH记忆），冻干过程pH状态有变化。1.冻干之前的保护措施:选择合适缓冲液；冷冻干燥保护剂（蔗糖，甘露醇）2.保证最佳解离状态：冻干之前或催化过程采取保护措施，如冻干之前缓冲液加冠醚（a-胰蛋白酶活力提高426倍）3.有机相缓冲液（七）离子强度55、 手性药物两种对映体的药理作用；手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物。类型：（1）一种对映体有显著疗效，另一种对映体疗效很弱或者没有疗效。如，萘普生（S比R高28倍）（2）一种对映体有疗效，另一种却有不良反应。如，反应停（S镇静，R致畸）（3）两种对映体疗效相反。如，5-（二甲丁基）-5-乙基巴比妥（左旋镇静，右旋兴奋）4）两种对映体具有各自不同的疗效。如喘速宁（S扩张支气管,R抑制血小板凝集）（5）两种对映体作用互补。如,心得安（S阻断8受体,R抑制钠离子通道）56、 酶反应器的类型及优缺点一、搅拌罐型：①分批搅拌罐式反应器，适用的酶：游离酶、固定化酶。优点是：设备简单，操作容易，酶与底物混合较均匀，传质阻力较小，反应比较完全，反应条件容易调节控制。缺点是：游离酶难以回收；固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。②连续搅拌罐式反应器，适用的酶：固定化酶。优点是：结构简单、操作简便、反应条件容易调节控制、底物与固定化酶接触较好、传质阻力较低、反应器的利用效率较高。缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。二、填充床式反应器：适用于：固定化酶。优点是：设备简单，操作方便，单位体积反应床固定化酶密度大，可以提高酶催化反应速度，因而，填充床反应器是目前工业生